生长素运输载体PIN在番茄花柄脱落过程中的作用机制及其钙素调控

In this study, tomato flower pedicel was used as experimental material. First, identify the auxin change of the explants vertically and horizontally in explants during the abscission, and build the auxin concentration distribution and transportation mechanism for regulating the abscission initially according to PIN Spatial-temporal expression, protein content and positioning change pattern; second, with the combination of RNAi silencing and over-expression candidate gene along with its affect on PIN protein positioning, screened out and identify critical genes for regulating the abscission; third, elucidate the calcium regulation mechanism and identify related members regulated directly by the calcium according to the effect of the calcium on corresponding gene expression and positioning of PIN; fourth, identified calcium-binding protein which regulates PIN phosphorylation rely on the yeast two-hybrid system and find the point on which the calcium acts directly. Finally, based on above conclusion, reveal the effect of the calcium on auxin inhibit abscission of the tomato flower pedicel, and make the foundation for the mechanism of calcium regulating IAA signal.

本研究以番茄花柄为试材，首先明确器官脱落过程中外植体垂直方向和水平方向上的生长素浓度梯度，并根据PIN时空表达，蛋白含量以及定位的变化规律，初步建立起调控脱落的生长素浓度分布及运输机制；其次，通过转基因技术沉默和超表达候选基因结合其对PIN蛋白定位的影响，筛选出调控脱落的关键基因；第三根据钙延缓脱落过程中，钙素对PIN相应基因表达及定位的作用，结合前期的研究结果，阐明钙素的调控机理并明确钙直接调控的相关成员；第四根据受钙调控的PIN蛋白，通过酵母双杂交技术筛选出特异调控PIN磷酸化的钙结合蛋白，找到钙直接作用的位点。最终结合以上结论，揭示钙在IAA延缓番茄花柄外植体脱落过程中的作用机制，为钙调控IAA信号作用模式研究打下基础。

利用生长素报告基因DR5::GUS植株，明确了番茄花柄脱落过程中生长素在离区部位的时空变化。质谱技术发现离区含量最高的PIN蛋白是PIN1，4，二者在脱落过程中蛋白丰度先降后升，较高的PIN1和PIN4蛋白利于离区生长素向下运输，此外表达谱分析PIN1和PIN4在脱落过程中具有特异性。利用VIGS 抑制PIN1,4表达可以显著抑制脱落发生速度。课题组进一步研究发现抑制PIN蛋白降解和改变其极性定位后，生长素分布异常，花柄脱落进程改变，表明PIN蛋白的稳定性及极性定位对脱落调控有至关重要的作用。对脱落样品进行磷酸化组织分析，找到PIN1，PIN4的磷酸化肽段及相应位点；明确了番茄花柄脱落过程中PIN1，PIN4的磷酸化位点的变化规律。利用酵母双杂交筛选磷酸化PIN1和PIN4对应的激酶。并通过BIFC实验验证PP2C与PIN1HL互做。用EDTA和NaF (PP2C磷酸酶抑制剂)处理发现改变生长素分布并抑制番茄花柄脱离，并且番茄离体花柄脱离过程中发现PP2C在脱离后期表达量明显增加，说明PP2C与番茄离体花柄脱离有关系。PP2C-RNAi沉默植株可以显著延缓脱落发生。利用酵母双杂交再次筛选和PP2C互作的蛋白，发现与其互作的SnRK1激酶蛋白，并进行分段试验，发现互作区域。SnRK1-VIGS明确其对脱落的调控规律。揭示PP2C影响脱落可能通过调控SnRK1以及PIN两个方面进行影响，其可能是生长素和碳水化合物调控脱落的作用节点。