基于micro RNA调控的生长素响应基因ARF延缓番茄花柄脱落的作用机制及其钙素调控

本研究在课题组已筛选出番茄花柄脱落过程中ARF表达变化较大的基因，并完成了加速和延缓脱落的调控因子microRNA测序，以及筛选出调控脱落的候选ARF成员和互补microRNA的基础上，以番茄花柄为试材，首先弄清花柄脱落过程中离区的ARF表达变化规律，筛选出参与生长素抑制番茄脱落的相应ARF基因，以明确生长素抑制番茄器官脱落的作用机制；其次通过VIGS获得突变体，明确和验证特异调控脱落的相应ARF基因；第三根据确定参与生长素抑制番茄脱落的相应ARF基因和通过Solexa测序获得microRNA，找到对应的互补microRNA，并通过分析其表达规律以及化学合成microRNA的类似物mimic和抑制子inhibitor验证其在脱落过程中的调控作用；最后通过钙处理检测ARF和pre-microRNA和microRNA表达。最终揭示钙在IAA延缓番茄花柄外植体脱落过程中的作用机制。

器官脱落发生是科学研究以及农业生产的热点，然而其发生的调控机制并不清楚。本文从延缓脱落的生长素作用因子入手，通过筛选调控脱落的关键ARF和其负调控因子microRNA来阐述脱落发生的作用机理。.对本体系诱导的花柄脱落进程进行了划分，明确了前8小时为脱落不敏感时期，利用生长素报告基因DR5::GUS植株，明确了脱落过程中生长素在离区部位的时空变化。结合脱落过程中生长素响应因子ARFs全家族的表达谱，并通过生长素处理延缓脱落，以及乙烯加速脱落过程中的ARFs变化，以及与其他物种中的调控脱落ARF功能分析，初步筛选出脱落相关ARF2,6,8,10,16,17。通过对脱落过程样品中的miRNA测序和降解组测序，鉴定出筛选出19在脱落过程中特异调控的miRNA。其在脱落，乙烯加速和1-MCP延缓脱落过程中的表达谱，结合靶基因和miRNA数据，初步明确调控脱落的miRNA成员以及其参与的调控路径。除了调控ARF6/8的miR167和ARF10，16, 17/miR160外，我们还筛选出了乙烯信号传导相关基因CTR1sv1/miR1917和EIN2/miR828。.构建了ARF2 RNAi和PARF2:: GUS植株，ARF2主要在生长点，小叶基部以及花粉和种子部位表达，结合ARF2 RNAi株系表型，其在延缓器官衰老方面起着重要作用; ARF14 RNAi植株，ARF14在调控叶片光合和衰老方面起重要作用; ARF10，16, 17/miR160超表达载体,以及相应的抗miRNA调控的靶基因超表达载体ARF10 mutant，ARF16mutant，和ARF17mutant。ARF10 mutant在调控叶片水分蒸腾过程中起重要作用。对ARF2和10, 16, 17/miR160，CTR4SV1/miR1917对于其花柄进行离体培养，发现ARF2RNAi，35S:: ARF16 mutant，35S:: miR160，35S::CTR4SV1和35S:: miR1917对于花柄脱落有显著影响。其中ARF2RNAi，35S:: miR160，35S::CTR4SV1 延缓脱落而35S:: ARF16 mutant 和35S:: miR1917加速脱落发生。. 以上筛选出的生长素响应基因和其负调控因子microRNA结果为阐述生长素延缓脱落和乙烯加速脱落过程的作用机制打下基础。