基于三维结构的TMEM16A通道钙离子激活机制和氯离子通透机制的研究

Calcium-activated chloride channels (CaCCs) are regulated by intracellular calcium and mediate the efflux of chloride. Dysfunction of it leads to various diseases. The most important thing of understanding the pathogenesis of CaCCs is to research for the structure-function relationship of the channel. That is to clarify the mechanism of calcium dependence and chloride transportation. Based on the transmembrane protein 16A (TMEM16A) which is identified as molecular basis of CaCCs, we will build the stereo structure of TMEM16A and simulate its dynamic process of calcium activation and chloride transportation by using homology modeling, molecular dynamic simulation and non-equilibrium statistical theories. The theoretical prediction will be verified by site directed mutagenesis and patch clamp experiments. We hope to reveal the mechanism of multisite collaborate and calcium dependent gating of the channel, to discuss the interaction between chloride and the channel, as well as to proposed model of the ion permeation of TMEM16A. The result will shed some light on the understanding of the chloride channels and drug development from molecular level.

钙激活型氯离子通道（CaCCs）是受钙离子调节的、介导氯离子跨膜外流的通道蛋白，其功能异常会诱发心肌梗死、高血压、癫痫及多种癌症等疾病。理解CaCCs致病机理的核心问题是关于其结构与功能关系的研究，即明晰其钙离子依赖性激活机制和氯离子通透机制。本项目从CaCCs的分子基础——跨膜蛋白16A(TMEM16A)的一级序列和同源蛋白nhTMEM16的三级结构出发，采用同源模建、分子动力学、非平衡态统计等交叉理论、并结合定点突变和膜片钳实验，对钙离子与TMEM16A的结合及其所引发的通道构象变化、氯离子与孔道的相互作用及氯离子通透过程进行理论模拟和实验验证，研究该通道蛋白钙离子依赖性的多位点协同调控机制，分析氯离子孔道及提出氯离子通透模型，为从分子水平上理解钙激活型氯离子通道的结构功能关系及靶向药物研发提供理论支持和实验依据。

背景：TMEM16A是由钙离子和电压双重调节的氯离子通道，具有重要的生理功能，它的功能障碍会导致高血压、囊性纤维化、哮喘、胃肠蠕动障碍、癌症等多种疾病,特别是TMEM16A在多种肿瘤中的过度表达，涉及细胞癌变的多个方面，探寻它的调控和通透机制，以及寻找高效、特异的调节剂是靶向药物开发的关键问题。然后，与阳离子通道相比，TMEM16A结构功能关系的研究远远滞后，最近三年获得了它及其同源蛋白的三维结构，为分子动力学结合电生理学实验研究它的分子机制提供了基础。. 内容与结果：本项目以钙离子结合态和非结合态的三维结构为基础，构建两种状态下TMEM16A蛋白全序列的结构，采用施力分子动力学和全原子分子动力学模拟，通过在模拟体系中加入膜电位，实现了钙离子结合态下的氯离子流动过程，分析了钙离子引发的TM6构象变化对孔道门控的影响，及在膜电位作用下的TM3-TM4与孔道的构象改变，探讨了膜电位与钙离子对TMEM16A的调控模式；选取十种起效高的调节剂，与TMEM16A三维结构进行对接发现：一些小分子在孔道顶部附近有明显的结合口袋，提出了抑制剂对通道的抑制机制；筛选验证了三种天然化合物小分子对TMEM16A的调控作用：人参皂苷和壳寡糖可以通过激活TMEM16A通道，促使肠道肌肉收缩力和收缩频率的增强，确认了TMEM16A通道可以作为治疗肠动力不足的药物靶标，苦参碱可以抑制肺腺癌细胞的内源性TMEM16A通道，从而对于肺腺癌细胞的增殖、迁移产生强烈的抑制作用。. 科学意义：TMEM16A是非常有希望的肿瘤标志物和癌症治疗的靶点。分子动力学模拟帮助我们理解阴离子通道的钙离子调控和氯离子通透机制、对其结构功能关系进行深入探讨，为与该通道相关的靶向药物分子筛选与设计提供理论支持和实验依据，推动理论与生理学实验相结合来解决生物学问题。