钙激活氯离子通道ANO1在卵泡发育中的作用和机制研究

Calcium-activated chloride channel Anoctamin 1(ANO1), which expresses on follicular granulosa cell membrane, is found to act as a new ovary local factor. It plays a key role in the regulation of estrogen synthesis , but its functions in folliculogenesis remains unclear. By using lentiviral vector mediated ANO1 gene-modified system and ANO1 specific inhibitor and activator in primary granulosa cells, the applicant of this grant found that ANO1 can not only increase progesterone synthesis, but also promote granulosa cell proliferation. Based on previous studies and our preliminary work, we hypothesize in this study that ANO1 plays very important roles in two aspects: First, it promotes follicular growth and follicular fluid accumulation by affecting granulosa cell proliferation and liquid secretion; Second, it regulates folliculogenesis by influencing steroidogenesis. We will test the hypothesis in this study by in vivo and in vitro experiments utilizing ANO1 conditional knock-out mice and 3D follicles culture. Furthermore, we will investigate and evaluate the roles and mechanisms of ANO1 in follicugenesis. The implementation of this project will provide novel theory basis for prevention and treatment of follicle and ovary disease.

表达于卵巢颗粒细胞膜上的钙激活氯离子通道ANO1作为新发现的卵巢局部调控因子，在调节雌激素合成的过程中起着关键的作用，但在卵泡发育过程中的其它功能尚不明确。申请人在原代培养的颗粒细胞中利用慢病毒介导的ANO1修饰体系以及ANO1特异性抑制剂和激活剂，发现：ANO1不仅可以提高孕激素的合成量，还可以促进卵巢颗粒细胞的增殖。据此我们在已有理论和前期研究基础上做出推测，ANO1在卵泡发育过程中的以下两个环节发挥着重要的作用：1. 通过促进颗粒细胞增殖、增加跨颗粒细胞的液体分泌量，从而促进卵泡生长和卵泡液的积聚；2. 同时以调节甾体激素合成量的方式参与调节卵泡发育的过程。本项目拟利用卵巢颗粒细胞ANO1条件敲除小鼠和卵泡的3D培养等方法，从体内和体外两条途径对上述推测进行验证，并深入研究其分子机制，综合评价ANO1在卵泡发育中的作用。本项目的实施将为卵泡和卵巢相关疾病的预防和治疗提供新的理论依据。

表达于卵巢颗粒细胞膜上的钙激活氯离子通道ANO1作为新发现的卵巢局部调控因子，在调节雌激素合成的过程中起着关键的作用，但在卵泡发育过程中的其它功能尚不明确。课题组在原代培养的颗粒细胞中利用慢病毒介导的ANO1修饰体系以及ANO1特异性抑制剂和激活剂，发现ANO1不仅可以提高孕激素的合成量，还可以促进卵巢颗粒细胞的增殖。本项目在已有理论和前期研究基础上，通过Cre-LoxP技术来建立只有在卵巢颗粒细胞敲除ANO1的条件敲除小鼠模型。首先，我们探索了ANO1参与调节甾体激素合成及分子机制，发现抑制ANO1可使颗粒细胞中雌激素水平升高和孕激素水平降低，而ANO1影响颗粒细胞孕激素分泌并不是通过影响StAR介导的孕激素转运方式实现的，可能是通过影响3β-HSD和MAPK的表达进而影响孕激素的合成。随后，我们验证了ANO1与CFTR在颗粒细胞上的定位、比重和在调控甾体激素合成过程中的互为补偿关系。我们还通过实验发现卵巢颗粒细胞敲除ANO1的条件敲除小鼠的排卵能力、产仔数较野生小鼠有所下降，颗粒细胞生长速度缓慢，增殖能力降低，说明ANO1可通过促进颗粒细胞发育、增殖进而促进卵泡生长，并且ANO1对有腔卵泡空腔的形成具有重要作用，参与着卵泡成熟的调节。综上所述，本项目揭示了ANO1在甾体激素合成、颗粒细胞增殖、卵泡发育、卵泡腔形成和小鼠排卵功能中的作用及其机制，为卵巢相关疾病的预防和治疗提供新的理论依据。