基于构效关系的茅苍术寡糖及多糖药效活性成分的辨识和质量控制研究

Oligosaccharides and polysaccharides are the important bioactive fractions in Chinese medicines. Their effects are highly correlated with characteristic structures. However, the quality control of them has the problems that the qualitative identification could not based on the characteristic structures and the accuracy of the quantification is unsatisfactory. Previous studies have been proven that carbohydrates especially oligosaccharides and polysaccharides in Atractylodes lancea have multiple pharmacological activities. However, the effective substance and structure-function relationship are still unclear, additionally lack of effective quality control method and geo-authentic research about carbohydrate is the difficulties of A. lancea in clinical applications. This project takes the advantage of membrane separation and FPLC-RID to get oligosaccharides with different degree polymerization and polysaccharides with different molecular weight. Then combined with their intestinal immune system modulating activity to find the active moiety efficiently. Develop the methylation analysis, which is high-throughput and microliter-scale, and specific enzymatic hydrolysis coupled with multiple chromatographic analysis to decoding the structure of active moiety. Establish HPSEC-MALLS-RID method to quantify polysaccharides directly and compare with the quantification result with totally acidic hydrolysis to estimate the accuracy and usability of two methods. By means of comparing the activity and characteristic structures of oligosaccharides and polysaccharides in A. lancea from different cultivated fields to elucidate the effective substances and structure-function relationship, and complete the quality control based on the bioactivity related chemical characters. At the same time, devote the data to support geo-authentic research of oligosaccharides and polysaccharides in A. lancea.

寡糖和多糖是中药的重要活性成分，其活性与特征结构密切相关。然而，其目前的质量控制普遍存在定性鉴别不能反映结构特征，定量分析不准确的问题。研究证实茅苍术中的寡糖及多糖具有良好的药理活性，然而药效物质基础不明确、构效关系不清楚、尚无有效的质量评价方法、道地性研究在糖类成分方面严重不足限制了茅苍术的有效使用。本项目首先利用膜分离结合FPLC-RID快速获得不同聚合度的寡糖单体及多糖组分，结合肠免疫活性评价，迅速锁定活性单元。针对活性单元开发高通量、微量化的甲基化分析及特异性酶水解结合多元色谱分析的方法，实现基于结构特征的特异性鉴别。建立HPSEC-MALLS-RID的方法直接定量多糖，并与完全酸水解定量相比较，考察方法的准确度与适用性。通过对不同产地的茅苍术进行活性比较以及结构表征，明确茅苍术寡糖及多糖的药效物质基础，阐明构效关系，建立有效的质量控制方法，同时为茅苍术的道地性研究提供支持。

糖类物质作为生命四大基础物质之一，参与细胞生物几乎所有的生命过程。糖类物质同时也是中药中的重要活性物质，具有资源丰富、结构多样、活性与特征结构密切相关的特点。本研究针对中药中的糖类物质普遍存在的药效物质基础不明确，质量控制方法定性鉴别不能反映结构特征，定量分析不准确的问题，以苍术为研究对象，主要开展了以下四方面的工作：（一）建立了苍术中不同聚合度的寡糖以及不同分子量多糖的快速富集方法，并对所获得的16个寡糖类成分以及4个分子量的纯化多糖进行了结构解析，明确了苍术中系列寡糖及多糖的结构，为后续药效物质基础以及构效关系的研究提供了原始材料；（二）分别建立了基于多糖分子量分布、单糖组成以及糖苷键类型的多元基于多糖特征结构的定性鉴别方法，并成功运用于茅苍术、北苍术及苍术混伪品的鉴别，结合化学计量学分析明确了2,6-linked-Galp糖苷键是区别茅苍主、北苍术及苍术混伪品的关键信息，为多糖的准确定性鉴别提供了方法；（三）建立了苍术中寡糖的定量方法，所建立的方法能够明显区分茅苍术与北苍术，说明寡糖类成分应该被纳入为苍术质量控制的指标性成分。并验证了替代对照品法在缺乏寡糖对照品的情况下对苍术中的寡糖类成分进行定量分析的可行性，为寡糖的质量控制提供了可供选择的方法。优化了多糖完全酸水解条件，同时结合多元色谱分析，建立了多糖的准确定量方法。解决了目前多糖普遍采用显色法定量不准确的问题。（四）建立了小鼠派尔氏结细胞模型结合巨噬细胞及细胞因子模型，对于苍术中的糖类成分进行了系统的活性评价，对分离纯化所得的不同结构的寡糖及多糖进行了构效关系研究，阐明了苍术中糖类成分的药效物质基础。寡糖中DP3-9活性成分段被证实具有较突出的肠道免疫调节活性，苍术多糖中阿拉伯糖分支结构以及主链中糖醛酸的含量提高对于苍术多糖活性的提高起着至关重要的作用。本研究为中药中糖类成分药效物质基础以及质量控制的研究提供了可供选择的思路以及方法。