γδT细胞FasL/Fas途径介导免疫突触形成及其抗骨肉瘤效应的分子机制研究

γδT细胞具有确凿的广谱杀灭肿瘤细胞功能，可能作为新的可应用于肿瘤治疗的免疫效应细胞，但其抗骨肉瘤的确切效应及相关分子机制尚未阐明。本课题将在已成功建立的体外扩增足够量的γδT细胞及体外分离培养骨肉瘤细胞的基础上，研究不同来源γδT细胞对骨肉瘤细胞的杀伤效应；检测这一过程中γδT细胞所分泌的细胞因子；应用特异性抗体分别阻断γδT 细胞表面Fas受体，TCRγδ受体，研究上述分子在γδT细胞杀伤骨肉瘤细胞过程中所起的作用，并以此推测γδT细胞抗骨肉瘤效应的可能机制；建立SCID小鼠肿瘤种植及γδT细胞过继免疫治疗模型（Hu-SCID），验证经体外实验推测的抗肿瘤途径。γδT细胞在体内外抗骨肉瘤细胞的效应及机制的阐明，将为骨肉瘤患者的临床免疫辅助治疗提供科学依据。

我们的主要研究结果的总结如下:首先，我们用体外扩增的γδT细胞杀骨肉瘤细胞株HOS和U2OS，IFN-γ显著增加γδT细胞杀伤预处理后的靶细胞。其次，类似于以前报告的数据，我们也发现，IFN-γ致敏的骨肉瘤细胞通过上调Fas受体Fas诱导的细胞凋亡。最后，IFN-γ增强γδT淋巴细胞的细胞毒活性通过细胞FasL / Fas系统。这些研究结果的基础上，我们得出结论，过继免疫治疗与IFN-γ相结合使用时，可有效增强骨肉瘤的辅助治疗效果。在我们的研究中，我们首先使用IFN-γ诱导Fas在骨肉瘤细胞HOS和U2OS的表达。γδT细胞在短期内是通过主要通过穿孔素介导杀伤作用。而为了确定对肿瘤细胞的Fas表达增加的功能性后果，我们使用了长期（18小时）测定γδT细胞的杀伤作用。 γδT细胞与肿瘤细胞共培养后，γδT细胞对骨肉瘤细胞株的细胞溶解的敏感性显着增加，HOS和U2OS在效靶比12:1时杀伤率达72％和94％。虽然γδT细胞对IFN-γ预处理骨肉瘤细胞系的的细胞毒作用的主要是由穿孔素的途径介导，γδT细胞杀伤IFN-γ预处理的骨肉瘤靶细胞部分由FAS介导，因为抑制Fas/FasL途径与抗FasL单克隆抗体显着减少γδT细胞的细胞毒作用。然而，FasL抗体未能完全抑制γδT细胞在未处理骨肉瘤的的细胞毒作用，从而表明IFN-γ增强γδT细胞在体外对敏感性肿瘤细胞株HOS和U2OS的细胞毒性作用与Fas增加相关。我们发现抗FasL抗体对γδT细胞的细胞毒性的抑制程度没有直接与肿瘤细胞Fas表达水平相关，由于广泛分布在骨肉瘤细胞的Fas/ FASL信号转导通路重要性，过继免疫细胞治疗联合IFN-γ，可能是骨肉瘤的治疗有前途的新战略。我们的研究使用来源于患者、复发和转移的骨肉瘤患者外周血单个核细胞的γδT细胞，表明过继性细胞免疫治疗可以促进骨肉瘤患者外周血的免疫反应，在体外扩增的γδ T细胞和ZOL可能是当前骨肉瘤的化疗和治疗中有效的补充。