人源抗恶性疟原虫工程抗体的免疫保护作用研究

Control and treatment of Plasmodium falciparum malaria is the key to eliminating malaria in global. Antibody plays a vital role in protective immunity against P. falciparum. This study is aimed to generate the full-length IgG3 subclass antibody of recombinant human-engineered antibody based on high-affinity human antibody monoclonal Fab fragment to the 19-kilodalton C-terminal merozoite surface protein 1 of P. falciparum, which inhibited merozoite to invasion into human erythrocytes. To establish stable high expression cell lines, the expression plasmids of the full-length IgG3 subclass antibody will be built and transfected into Chinese hamster ovary cell (CHO). Human full-length anti-MSP119 IgG3 subclass antibody with the complete antibody functional activity was generated and purified. To clarify the mechanism by which anti-MSP119 human IgG3 subclass antibodies protect human against P. falciparum infection, we evaluate the activities of the antibody to inhibit merozoites to invade human erythrocytes, to inhibit the development of parasites following invasion, and to kill merozoites by opsonization, complement dependent cytotoxicity, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). The study will provide the theoretical and experimental basis for in vivo experiments with the monkey as an animal model, promote China's original and independent knowledge of anti-Plasmodium falciparum antibody drugs to the clinical, and develop a new strategy for the treatment of falciparum malaria.

恶性疟的防治是消除疟疾的难点。抗体在恶性疟的保护性免疫中起着至关重要的作用。本课题将已得到的高亲和力并具有抑制作用的抗恶性疟原虫MSP119抗体的Fab片段进行全长化IgG3亚型抗体改造，构建IgG3亚型抗体的轻重链全长表达载体，通过筛选得到稳定高表达人源抗体的细胞株，制备出具有完整抗体功能活性的人源全长抗MSP119的IgG3亚型抗体。研究人源抗MSP119的IgG3亚型抗体阻断与抑制裂殖子入侵红细胞、随裂殖子进入红细胞后对红细胞内的虫体发育影响，以及抗体通过激活补体系统和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用以及抗体调理功能对恶性疟原虫裂殖子的杀伤作用，来阐明人源抗MSP119的IgG3亚型抗体在保护人体抵抗恶性疟原虫感染的保护作用机制，为下一步以猴子为动物模型的体内实验提供理论和实验基础，推动我国原创性和具有自主知识的抗恶性疟人源抗体药物走向临床，为恶性疟的防治提供新的策略。

恶性疟的防治是消除疟疾的难点。抗体在恶性疟的保护性免疫中起着至关重要的作用。本课题对已得到的高亲和力并具有抑制作用的抗恶性疟原虫MSP119 抗体的Fab 片段进行全长化IgG1和IgG3 亚型抗体改造，构建IgG3 亚型抗体的轻重链全长表达载体，通过筛选得到稳定高表达人源抗恶性疟原虫抗体IgG1的细胞株13株，稳定表达人源抗恶性疟原虫抗体IgG3细胞株7株，经过大规模培养制备抗体，人源抗恶性疟原虫抗体IgG1细胞株6w7C8产量可达到15mg/L；人源抗恶性疟原虫抗体IgG3细胞株A4B4产量可达 18mg/L。经Biacore检测，人源抗恶性疟原虫抗体IgG1和IgG3与MSP119的高亲和力较原始Fab片段提高30倍，其中人源抗恶性疟原虫抗体IgG1的亲和常数为2.33E+10M，解离常数为4.29E-11M，人源抗恶性疟原虫抗体IgG3的亲和常数为2.82E+10M，解离常数为3.67E-11M。体外实验，抗恶性疟原虫的人源抗体对恶性疟原虫裂殖子入侵的抑制作用随抗体浓度的增加而提高，当抗体浓度为100 μg/ml时，抗恶性疟原虫IgG1的抑制作用最高，达到59.4%。当抗体浓度为200μg/ml时，抗恶性疟原虫IgG1的抑制作用最高，达到54.6%。抗恶性疟原虫MSP119的人源抗体IgG1的作用位点主要在33KD和19kD上，其抑制恶性疟原虫裂殖子入侵主要是通过阻断MSP142的进一步加工合成MSP133和MSP119。本研究得到的抗恶性疟原虫抗体IgG1和IgG3不仅可以特异性识别恶性疟原虫裂殖子，还可以具有抑制恶性疟原虫入侵红细胞作用，并阐明了其作用机理，为抗恶性疟原虫抗体药物的研制奠定基础。由于在恶性疟原原虫感染过程中，抗体的亚型转化在抗疟原虫的免疫机制具有重要的作用。为此，本研究分别制备了具有相同抗原结合位点的不同亚型IgG1和IgG3抗体，为阐明抗体亚型转化在疟疾感染过程作用机制的研究奠定基础。