基于代谢组学的高温致畸生物标记物的发现及分子机制

高温所致神经管畸形（NTDs）的机制一直未阐明，探究其机理和抗畸措施无疑对降低出生缺陷具有重大的实际意义。代谢组作为细胞生命活动的基本层面，在致畸过程中的变化可能作为发现新型生物标记物和致畸作用机理的新途径。我们的前期研究发现，高温可致SD孕鼠畸形胎仔的羊水1H-NMR的代谢物图谱发生显著变化，表现为葡萄糖下降，组氨酸升高等。本课题拟采用代谢组学研究策略，利用核磁共振分析技术，对高温干预后的鸡胚体液（尿、羊水）、妊娠动物体液（血、尿、羊水）和人胚胎干细胞（培养液）中内源性代谢物全谱的动态变化进行分析，从体内外、禽类到哺乳动物、再到人的胚胎干细胞，多层次、多角度地建立与高温致NTDs相关的"代谢组学特征谱"，以期发现特异性、高灵敏度、较好预测力的新型生物标记物，并对其产生原因及可能的致畸机制进行初步探索。本课题拓展了高温致畸基础研究的新领域，为寻求抗致畸措施提供了实验依据和理论基础。

本课题完成了四个物种与畸形相关代谢组的探究及初步验证，主要结果如下：①高温和维生素A对SD孕鼠致畸作用的代谢组学研究 在SD孕鼠器官形成期给予高温和维生素A，收集孕鼠尿液、血液和羊水，并用１H-NMR测定代谢组。与高温致畸相关的主要特征代谢物表现为醋酸、肌醇、磷酸肌酸、乳酸等明显升高，葡萄糖、丙胺酸、脯氨酸和酪氨酸等明显下降，醋酸升高约1.59倍。用环磷酰胺（CP）干预器官形成期的SD孕鼠，采用酶组织化学的方法对胎盘和胚胎肝脏的琥珀酸脱氢酶（SDH）和乳酸脱氢酶（LDH）的表达进行探索，观察胎盘显示微血管形态的碱性磷酸酶（AKP）。发现AKP降低， SDH降低，LDH升高，印证了高温缺血缺氧相关致畸代谢物谱的特征性变化。②高温和CP鸡胚致畸试验的代谢组学研究 用高温和CP在第3天干预，采集9天鸡胚的羊水进行1H-NMR代谢组研究，并进行组织学和电镜观察。高温造模未获得理想结果。CP鸡胚羊水畸形代谢谱主要影响脂质代谢，组织学改变为皮下水肿，间充质增多和肺、肝、肾、脑等脏器发育严重滞后。透射电镜结果显示畸形组细胞器较幼稚，线粒体肿胀。③沙利度胺家兔致畸试验的代谢组学研究及其初步验证 以沙利度胺（Thd）干预器官形成期的家兔，动态采集孕兔静脉血和终末羊水进行氢谱核磁代谢组测定。Thd组家兔的特征代谢物为胆碱，甜菜碱，谷氨酰胺等升高。动态孕兔血清代谢物谱的共性变化是异亮氨酸（ISO）的显著下降。这是获得的最有畸形预测价值和创新性的研究成果。利用鸡胚模型，验证ISO对Thd致畸鸡胚的保护作用。结果发现ISO能显著改善Thd造成的短肢畸形，并增加活胚体重，组织学亦发现ISO能显著改善Thd造成的皮肤和视网膜发育迟滞。该研究成果为探索孕期补充异亮氨酸以预防畸形提供了理论基础和实验室数据，但还需要进一步验证。④人类畸形胎儿羊水代谢组学研究 收集心脏畸形、唇腭裂、水囊瘤和染色体异常等的妊娠中期23-40岁妇女和同年龄段正常对照组的羊水进行1H-NMR代谢组分析，有统计学意义的差异代谢物表现为二甲胺升高318%，丝氨酸下降29%，2-羟基异丁酸升高202%，甲硫氨酸下降32%等。甲硫氨酸可能作为人类畸形的代谢标志物，我们正在进行验证。在基金委的资助下，本项目完成了两篇博士论文，已发表或接受文章4篇，待发表文章3~4篇。达到了青年基金培养人才，为进一步深入研究提供线索和创造条件的目标。