秦岭放线菌中新型抗真菌脂肽物质的发现与其功能导向的生物合成途径改造

With the development of agriculture in China, the control of the plant pathogenic fungi is becoming an important scientific problem, which urgently requires discovery of new effective compounds. The diverse ecosystem in Qinling Mountains provides a large number of microorganisms that are virtually new sources of novel bioactive compounds. Streptomyces cacaoi subsp. asoensis H2S5 was isolated from the moss soil in North Slope of Qinling Mountains. The bioinformatics analysis of its whole genome together with the chemical composition analysis reveals the presence of gene clusters for possible biosynthesis of novel hybrid polyketide- nonribosomal peptides (PKS-NRPs). In this project, we will use a combination strategy of genome mining, HPLC-PDA metabolomics and antifungal bioassay fractionation analysis to survey the novel lipopeptides encoded by PKS-NRPs gene clusters. This genome-metabolome based strategy enables detection of novel compounds, which lay the foundation for the studies and application of agricultural antibiotics. Then, the isolation and structure elucidation of target lipopeptides will be further accomplished with a combination of chromatographic and spectroscopic methods, including HPLC, LC-MS and extensive NMR, CD, ECD analysis.

植物病原真菌的防治是我国农业发展过程中的重大科学问题之一，目前迫切需要一种新型有效的防治药物。秦岭特色的微生物为植物病原真菌的生物防治提供了丰富的资源。本申请项目拟对秦岭主峰太白山北坡苔藓土壤放线菌Streptomyces cacaoi subsp. asoensis H2S5展开研究，挖掘其合成新型脂肽类化合物的潜力。通过生物信息学分析策略对新颖的杂合聚酮-非核糖体肽合成酶（PKS-NRPS）生物合成基因簇展开定向筛选和表征；采用基因簇异源表达，功能基因突变等方法，对目标基因簇展开功能导向的生物合成途径改造，获得多种突变菌株；通过HPLC-PDA代谢组学去重分析与抗真菌活性分析等方法，锁定基因簇编码化合物的结构与生物活性特征，追踪分离新脂肽类化合物；并开展其抗植物病原真菌活性测试，以期获得强活性新型脂肽类化合物，为新型农用抗生素的研发奠定基础，探索微生物资源深度利用的新途径。

微生物天然产物因其结构多样，生物活性显著，以及次级代谢产物重现性好，成为了药物或药物先导分子的重要源泉。本项目旨在通过各种化学与分子生物学手段，挖掘微生物中的活性化合物，主要以秦岭来源土壤链霉菌为研究对象，优化其发酵条件，利用正反相色谱层析、葡聚糖凝胶层析、高速逆流色谱技术和高效液相色谱等多项技术对菌株发酵提取物进行分离纯化，综合运用1D/2D NMR、MS、IR和UV等波谱分析方法鉴定出了14个化合物，其中包含8个新天然产物；化合物绝对构型的鉴定主要结合ECD、关键酶的立体选择性分析以及化学反应等方法。同时，对活性化合物进行了多种生物活性评价及作用机制探讨。最后，对特殊生境来源的链霉菌H2S5做了全基因组测序，从生物信息学角度分析了其代谢潜能，并初步探索了其遗传操作体系。通过遗传操作，获得了一个具有潜力的突变菌株。主要研究结果如下：.综合HPLC分析以及活性向导，从80株秦岭放线菌中筛选出了一株可可链霉菌H2S5作为目标菌株，从其培养物中共分离鉴定出三烯霉素类化合物，其中包含一个稀有的含葡萄糖基团的三烯霉素类化合物，以及具有5/6/7新颖稠环结构的二烯霉素类化合物。通过化学反应与ECD计算等方法确定了新化合物的绝对构型。该类型三烯霉素均有细胞毒活性与抗真菌活性。对秦岭链霉菌H2S5进行了全基因组测序，分析结果显示，其基因组为10.04 Mb，GC含量为71.0%，含31个次级代谢产物基因簇，涉及I型、II型、III型PKS、NRPS和PKS-NRPS等多种类型。经与mycotrienin基因簇（myc）的基因功能比对分析，确定tir基因簇为三烯霉素类化合物的生物合成基因簇。针对tir基因簇中的调控基因、骨架合成基因PKS以及负责前体合成的基因构建了5个遗传改造用载体。总而言之，本项目通过研究特殊生境链霉菌的化学成分及其生物活性，挖掘出了极具开发前景的治疗前列腺癌与肝癌的药物先导分子，并获得了一株特异性的突变菌株，这为这株链霉菌的生物合成研究奠定了坚实的研究基础。