TRPV1通道介导的蒙药诃子制草乌“减毒存效”炮制原理研究

Fructus Chebulae Processed Radix Aconiti Kusnezoffii is a characteristic processing method in Mongolian Medicine, which can both reduce the toxity and retain the effect， while the mechanism is still unclear. We have found that Fructus Chebulae Processed Radix Aconiti Kusnezoffii can not decrease the amount of diester-type aconitum alkaloids as TCM processed Radix Aconiti Kusnezoffii do , which suggest there may have a different toxicity reducing reason. TRPV1 are both the targets of treating inflammatory pain and the channels mediate cardiotoxicity. Myrobalan tannic acid, on the one hand, can suppress the intracellular Ca2+ overload and mitochondria damage mediated by TRPV1 Channels, on the other hand, can also promote Channel desensitization and increase anti-inflammatory and analgesic effects because of its acidic pH value. Hereby, we present a hypothesis: The components in Fructus Chebulae and in Radix Aconiti Kusnezoffii including Myrobalan tannic acid and aconitine can give a combine action on TRPV1 channel, by decreasing the amount of intracellular Ca2+ and promoting desensitization, Fructus Chebulae Processed Radix Aconiti Kusnezoffii play its role of toxity reducing and effect retaining effectively. First, we are going to prove the above hypothesis, and then we will screen the material basis of Fructus Chebulae Processed Radix Aconiti Kusnezoffii by using the method of components-toxity-effect analyse and Receptor ligands competition-HPLC-MS. Last, we will try to illuminte the molecule mechanism by using whole cell patch clamp technique. This project can guide the characteristic processing method in Mongolian Medicine application in clinic safetly, and also can provide a research idea on Processsing Machanism.

诃子制草乌是蒙药特色炮制技术,具有减毒存效作用,但炮制原理尚不明确。前期研究发现诃子制草乌不能降低剧毒双酯型生物碱的含量,蒙药诃子制草乌的炮制减毒途径有别于中药炮制草乌。TRPV1通道既是乌头类药物治疗炎性热痛的重要靶点,又是引起心肌毒性的关键通道。诃子鞣酸等成分一方面可以抑制TRPV1介导的细胞内Ca2+超载和线粒体损伤,另一方面其酸性PH还能够敏化TRPV1通道,增强抗炎镇痛作用。据此,我们提出假说:诃子中的鞣酸等成分与草乌中的乌头碱类成分共同作用于TRPV1通道,通过促进通道脱敏和降低细胞内Ca2+含量，实现减毒、存效的目的。我们将首先证明诃子制草乌通过TRPV1通道发挥“减毒存效”作用;进一步利用“谱-毒-效”分析,受体配体竞争结合-HPLC-MS联用技术筛选物质基础；最后利用膜片钳等技术阐明分子机制。该项目可为指导蒙药特色方法临床应用奠定基础,也可对其他炮制研究提供思路。

本项目以TRPV1受体为切入点，研究诃子制草乌的炮制原理。项目首先确定了炮制诃子制草乌的最佳工艺参数：草乌与诃子比例为2:1，浸泡液体积比为6：1，浸泡时间为3天。其次，利用UPLC-Orbitrap-MS法比较了生草乌和诃子制草乌的成分差异，诃子制草乌中原草乌的化学成分改变不大，保留了大量双酯型生物碱，单酯型和醇胺型生物碱含量稍有下降；诃子中10种化学成分经过炮制后引入饮片中。项目还阐明了诃子制草乌的减毒效果与TRPV1的关系：生草乌心肌细胞毒性较大，与同质量浓度生草乌相比，诃子制草乌组细胞活力显著上升，细胞中LDH漏出率，ROS 及 Ca2+释放量减少，线粒体膜电位升高，细胞核形态有所改善。但上述改善作用在作用于TRPV1抑制剂 BCTC 预处理后的心肌细胞后受到抑制，Real-time PCR 结果表明生草乌和辅料诃子汤均能使心肌细胞中 TRPV1 mRNA 表达量增多。以上结果表明生草乌可通过激活 TRPV1 通道诱导心肌细胞凋亡，引发心脏毒性；而诃子制草乌可通过 TRPV1 通道介导起到减毒作用，其减毒作用的发挥可能与诃子中的酸性成分和草乌中的生物碱协同作用于 TRPV1 通道有关。在特征图谱的基础上，选择特征成分进行均匀设计，以细胞存活率胞存活率为指标，确定诃子制草乌特征成分中的毒性成分和具有减毒作用的成分，并从LDH漏出率，细胞核平均荧光强度和线粒体膜电位角度进行综合验证，结果表明：新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱均可明显降低H9c2心肌细胞存活率，其中新乌头碱对毒性的贡献较大，相反诃子中的没食子酸、鞣花酸可在一定程度上提高细胞存活率，其中以没食子酸的贡献较大。采用全细胞膜片钳及钙离子成像观察特征成分没食子酸和新乌头碱单独或联合使用对TRPV1通道的影响。结果表明，单独使用新乌头碱和没食子酸都能够引起TRPV1通道电流的产生，而没食子酸和新乌头碱联合处理使TRPV1通道电流的产生明显减弱。我们的数据表明，诃子制草乌的减毒机制可能与辅料和主药联合应用使TRPV1通道的脱敏有关。本项目初步证实了TRPV1通道是诃子制草乌发挥减毒存效作用的关键离子通道，为阐明炮制原理奠定了基础。