钴纳米粒子基因毒性与金属—金属人工全髋置换术后致瘤性的关系

本研究拟采用基因表达芯片技术、生物信息、纳米级形态功能检测、体内与体外实验相结合的方法，首次在纳米级水平探索金属-金属人工全髋关节置换术后主要降解产物之一钴纳米粒子的分子生物相容性及长期蓄积所致生物学效应。通过体外细胞急性毒性实验，采用基因芯片技术筛选重要的差异表达基因，探讨差异基因表达模式与基因功能间的关联；实验干预调节对DNA损伤和修复相关基因表达间的联系；DNA损伤、修复过程中的可能路径与差异表达基因间的联系；从而在分子水平探索不同表征特性的钴纳米粒子对细胞的基因毒性机制。通过建立模拟机体真实暴露方式的钴纳米粒子体内慢性毒理实验动物模型，探讨钴纳米粒子的基本参数与体内分布、消除的相关性；从多脏器组织学及超微结构层面观察是否出现肿瘤及可能出现肿瘤的时间、部位、数量与类型，从而客观评价钴纳米粒子长期蓄积于体内是否存在致瘤性，为解决长期困惑临床的难题提供科学依据。本研究内容国内外未见报告。

背景：金属对金属人工关节已被大量使用在关节外科中，但MOM术后受到体内物理化学等因素的影响，其降解产物之一钴纳米颗粒所致的细胞毒性及基因毒性应得到广泛关注，同时应明确其所致细胞毒性及基因毒性的机制，并寻找其降低毒性的方法。目前国内研究仅停留在临床回顾性研究及金属离子实验研究阶段。因此，需要在纳米分子水平对钴纳米颗粒造成细胞毒性以及基因毒性的具体机制以及通路进行更深层次的研究。尤其是科学探讨MOM人工全髋术后金属降解产物长期蓄积是否具有致瘤性显得十分必要。 主要研究内容：通过TEM,SEM,XRD对30nm、50nm、100nm钴纳米颗粒基本参数测定，包括颗粒尺寸、粒径分布、聚合状态、表征形态。分析不同表征的钴纳米颗粒及离子在细胞毒性方面的量-效和时-效异同点，探讨生物学效应方面的相互联系与影响。运用多孔板和荧光显微镜检测细胞内活性氧的生成以及抗氧化物GSH,HO-1等的变化。运用Western bolt和PCR技术对凋亡通路中表达异常的蛋白质与基因进行筛选。通过对细胞内氧化应激的变化与凋亡通路中各分子的表达异常，探讨细胞内氧化应激与细胞凋亡之间联系及其机制。通过加入抗氧化剂NAC,AA抑制细胞氧化应激水平，探讨其对细胞的降毒作用。在术后1、2、3年处死大鼠并切取关节周围组织、肝脏、肾脏和骨髓的病理切片检查，同时行电镜超微结构检测，探讨钴纳米颗粒基本参数(如颗粒尺寸、粒径分布等)与体内分布消除相关性及潜在的致瘤性。 数据与结果：本课题组已成功制备平均粒径在50nm和100nm的钴纳米颗粒。通过单细胞凝胶电泳发现10-3M浓度50nm、100nm钴纳米颗粒在体外染毒人成纤维细胞2小时可引起DNA显著断裂。已成功建立人体微量血测定血钴、血铬浓度的电化学检测法.钴元素在各主要脏器均有分布，肝脏中积聚最多，其顺序依次为肝>脾>肾>心。并且随着钴纳米颗粒尺寸的减少及剂量的升高，各主要脏器中钴含量有增加的趋势。钴纳米颗粒具有细胞毒性和基因毒性，较氯化钴毒性更强，弱于Co2+。呈浓度、时间依赖关系。男性和女性RHA后血清钴铬离子水平均较术前升高，术后6个月时达到峰值。术后9个月男性组铬离子浓度显著高于女性组。不同构成比的钴铬合金纳米粒子与按其比例混合的纯钴、纯铬纳米粒子相比IC50的浓度出现不同，前者浓度较低，同时只需小剂量即可产生明显彗尾现象，提示钴铬纳米粒子的细胞毒性较强。