苏云金杆菌Cry毒素抗假眼小绿叶蝉的定向筛选与改造

利用短肽文库展示、融合蛋白表达和荧光差异显示等多种分子生物学技术寻找可以和茶假眼小绿叶蝉中肠结合的短肽；并应用定点突变等分子操作方法将筛选到的短肽用于改造Cry1A和Cry3A毒素，期望改造后的毒素具有能够和茶假眼小绿叶蝉中肠结合的功能。此后，运用SDS-PAGE、免疫印迹等生物化学手段验证改造后的Cry1A和Cry3A蛋白和叶蝉中肠细胞膜结合并进行毒理测定。本研究探索将Cry毒素用于防治我国重要的茶叶害虫茶假眼小绿叶蝉的可能性，为扩展Cry毒素蛋白用于防治半翅目和同翅目害虫提供理论和应用基础，并为用分子工程手段发展新型害虫毒素提供新的思路和方向。

本研究筛选出多条能与假眼小绿叶蝉中肠刷状缘膜囊泡（brash border membrane vesicle, BBMV）结合的短肽。同时，还以同为半翅目刺吸式口器害虫的褐飞虱作为对象，分别筛选出能够与其中肠内膜及BBMV结合的短肽。利用获得的短肽对苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）Cry1Ab毒素domainⅡ中受体结合功能域进行逐一替换构建了6株重构Cry毒素：Cry1Ab-1S、Cry1Ab-2S、Cry1Ab-3S、Cry1Ab-1Z、Cry1Ab-2Z及Cry1Ab-3Z。经蛋白稳定性测定、结合活性测定及生物测定，发现Cry1Ab-2S对褐飞虱毒性作用较之未改造Cry1Ab毒素提高了13倍，致死中浓度（LC50）达17.47 μg/mL。通过激光共聚焦显微镜及透射电镜观察证明Cry1Ab-2S能够与褐飞虱中肠内膜上皮细胞中某个受体结合并对肠道上皮细胞产生消解。此外，本研究还对Cry1Ab毒素在褐飞虱体内的活化情况进行分析，并对Cry1Ab毒素在半翅目刺吸式口器昆虫中肠内的作用机制进行了讨论。