转Cry1Ac基因甘蔗RNAi双价抗病毒聚合遗传改造技术体系研究

甘蔗是重要的糖料和能源作物，且转基因安全等级最高。病害（花叶病、黄叶病）、虫害是影响甘蔗生产的重要因素。项目组在获得的转cry1Ac基因甘蔗的基础上，针对甘蔗花叶病毒和黄叶病毒株系多样且日趋严重而杂交育种困难和单病毒转基因改良抗性不足问题，拟利用RNAi技术原理，根据前期研究，花叶病以病原CP蛋白和HC-pro基因为靶标基因，黄叶病以病源CP蛋白基因为靶标基因，以同源基因序列比对后的保守序列为干扰序列，把花叶病不同蛋白干扰序列与黄叶病干扰序列连接形成融合片段，利用添加的酶切位点构建具有融合片段反向重复序列的RNAi植物表达载体。采用农杆菌侵染和基因盒基因枪轰击，创制带有不同花叶病和黄叶病蛋白干扰序列的转基因甘蔗群体，通过不同转化事件病毒基因的表达及抗病、虫效果鉴定，建立甘蔗多价转基因改良技术体系，为同类研究提供借鉴；创制的抗病、抗虫材料可用于选育优良新品种，具有很大应用前景。

甘蔗是重要的糖料和能源作物，转基因安全等级高。甘蔗花叶病、黄叶病和害虫是影响甘蔗生产的主要因素。品种除草剂抗性是适应现代机械化生产的需要，可显著降低生产成本、提升竞争力。甘蔗是高度杂合的异源多倍体植物，遗传背景非常复杂，并且抗病虫、除草剂等特异种质资源匮乏，因此，通过杂交育种的方式选育多性状聚合的优良品种异常困难。可以实现定向改良的基因工程技术是未来的发展方向。项目组以自育的常规甘蔗品种和转cry1Ac基因甘蔗为基础，针对甘蔗花叶病毒和黄叶病毒株系多样且日趋严重而单病毒转基因改良抗性不足等问题，利用RNAi技术原理，以花叶病毒CP蛋白、HC-pro基因和黄叶病CP蛋白基因为靶标基因，以同源基因序列比对后的保守序列为干扰序列，把花叶病和黄叶病干扰序列连接形成融合片段，利用添加的酶切位点构建了具有融合片段反向重复序列的RNAi双价抗花叶病和黄叶病植物表达载体。针对转cry1Ac基因甘蔗二次转基因改良过程中转化植株生根困难的问题，在双价RNAi抗病表达载体中引入了抗虫和抗除草剂基因，构建了四价抗病虫除草剂植物表达载体。采用农杆菌侵染和基因枪轰击方法创制了双价抗病和四价抗病虫除草剂转基因甘蔗群体。通过对分子鉴定的部分转基因植株基因表达以及抗病、虫效果初步分析，结果显示将抗虫、抗除草剂功能基因和RNAi双价干扰结构构建在同一表达载体上并进行一次转化，获得的转基因植株均可以正常生根，且RNAi双价干扰结构不会造成功能基因沉默，两种不同机制下目的基因都可以表达，但在有的植株内存在特殊关系，值得深入研究。研究使用的基因、创制的RNAi双价干扰结构、构建的表达载体、优化的转化方法、获得的转基因甘蔗群体等为甘蔗多价聚合转基因改良提供了关键技术，实现了项目目标。特别是创制的抗病、虫、除草剂转基因甘蔗群体不仅可用于选育优良甘蔗新品种，大幅降低甘蔗生产成本，而且集RNAi抗病机制和抗虫、抗除草剂功能基因于一体的转基因甘蔗群体，为进一步研究不同基因表达调控机制下外源基因表达与作物自身生长之间的关系以及单一或多种靶标因子作用下不同基因间表达互作关系提供了优异材料，深入研究对于指导不同机制多价转基因聚合育种具有重要意义。项目执行过程中培养研究生3名，2位项目成员晋升中级职称，1位晋升正高级职称并获得博士生导师资格，项目研究成果已申请发明专利5项，发表论文4篇，2篇文章待发表。全面完成各项指标。