基于RNAi和转基因技术改造甘蔗抗花叶病性研究

甘蔗是重要的糖料和能源作物，甘蔗花叶病危害甘蔗造成减产和品种退化。项目针对病毒株系分化严重，杂交育种培育多抗品种困难，单一病毒株系CP基因介导抗性对其它株系抗性不足，拟借助RNAi技术原理，综合运用生物信息学、基因工程、组织培养、分子检测鉴定和常规育种技术，以病原CP和HC-pro基因为靶标基因，以不同株系蛋白基因序列比对后的保守序列为干扰序列，通过导入完整表达载体和基因盒（gene cassettes），创制带有靶向不同蛋白基因和不同RNAi靶序列的转基因甘蔗，通过评价不同靶标基因和不同靶序列干扰病毒基因表达及其对抗病性的效应，建立有效的、改造甘蔗抗病性的RNAi技术体系以及靶标基因和靶序列的选择与设计方法，发展甘蔗转基因育种新技术，并为后续同类研究和抗病核心种质创制提供实验依据，所创制的高抗和抗多个病毒株系遗传修饰材料可直接应用于育种，项目研究具有重要的科学价值和应用前景。

摘要 甘蔗花叶病是甘蔗栽培上最重要的病害之一，导致产量和蔗糖分下降。项目针对甘蔗遗传背景复杂，病原株系分化严重，常规杂交培育抗多个病毒株系品种困难，完整CP基因介导抗性不足，拟采取RNAi技术，以最主要病原SrMV-H为目标病原，以病毒关键蛋白CP基因和HC-pro基因的高度保守序列设计干扰序列，目标是创制抗多个株系的抗病材料并发展甘蔗转基因育种的核心技术，并了解RNAi对抗性改造效果的影响。.主要研究内容和重要结果如下：.1、完成了1个带有干扰CP 基因序列、2个带有干扰HC-pro基因序列共3个植物完整表达载体的构建，经酶切和测序列验证后用于遗传转化甘蔗。.2、建立了以甘露醇和以除草剂“农达”为底物的转化子筛选和组织培养再生和遗传转化技术体系，形成 1 件国家发明专利 “一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法” 获得授权（专利号：ZL201210070463）。.3、通过gus 基因瞬间表达效率的研究，优化了农杆菌介导的甘蔗转化技术体系，形成 1 件国家发明专利“一种提高农杆菌介导的甘蔗gus瞬时表达率方法”2012-09-26已通过实质审查，待授权（申请号：20111043054054）。.4、获得了带有干扰序列的转基因植株，经人工接种，筛选出抗花叶病且具体为兼抗SrMV-H和SCMV-E病毒株系的转基因甘蔗。.5、对2个RNAi甘蔗株系进行扩繁，扩繁技术形成了 1 件国家发明专利“利用甘蔗汁促进甘蔗壮苗的组培方法”并获得授权（专利号：ZL201010578865.8）。.6、研究了SrMV-H胁迫下，转基因抗病株系与非转基因系在转录组水平上的变化，获得初步结果。.相关研究已申报3件国家发明专利，2件获得了授权，另1件也已通过审查；已发表论文4篇，其中SCI Ⅲ区论文1篇，核心期刊3篇，待发表论文2篇；培养硕士研究生4人。.本研究在甘蔗上最先实践了利用 RNAi技术原理，培育出多抗（抗SrMV-H和SCMV-E株系）转基因甘蔗。最先在甘蔗上证明了该技术对于培育多抗病毒株系的有效性；提出了有关干扰序列设计的技术，建立利用gus基因瞬间表达优化农杆菌介导甘蔗遗传转化技术体系，并利用所建立的技术体系获得了一批RNAi转基因甘蔗株系，上述技术方法和体系以及甘蔗组培壮苗的技术方法可在相关研究中借鉴。此外，所获得的抗多个病毒株系的材料在获国家安全许可后可用于育种。