LncRNA MALAT1/miR-30-5p环路在Cthrc1抗肝纤维化中的作用和机制研究

Liver fibrosis, a response to a variety of chronic liver injury factors, is characterized by excessive deposition of extracellular matrix in liver. It can damage the normal structure of liver, affects the physiological functions of the liver, and eventually leads to avariety of end-stage liver disease and death. Collagen triple helix repeat containing 1 (Cthrc1) has been verificated to ameliorate hepatic fobrosis by TGF-β/Smad negative feedback loop. Long non coding (lnc) RNAs have been known to play an important role in several diseases; however, the mechanism of lncRNAs in liver fibrogenesis is still unknown. LncRNA-MALAT1 was found to be overexpressed in human liver fibrosis tissue in our previous studies. Downregulation of MALAT1 significantly inhibited the expression of SMAD3 mRNA. However, overexpression of miR-30a-5p downregulated MALAT1. Therefore, we assume that MALAT1 interacts with miR-30a-5p and promotes liver fibrogenesis through TGF-β/Smad /Cthrc1 pathway. We will explore the mechanism of LncRNA-MALAT1-miR-30a-5p loop in liver fibrogenesis via in vitro, in vivo experiments and patient samples; determine the significance of MALAT1 as a new target in the treatment of liver fibrosis.

肝纤维化是肝脏对多种慢性肝损伤因素的修复反应，以细胞外基质过多沉积为特征，可破坏肝脏结构，影响肝脏功能，导致终末期肝病甚至死亡。我们的前期研究表明胶原三螺旋重复蛋白1（Cthrc1）可通过负反馈调节TGF-β/Smad通路影响肝纤维化的发生发展。LncRNA在肝纤维化发生发展中的作用至今未明。我们已发现lncRNA-MALAT1在肝纤维化组织中高表达，敲低MALAT1后SMAD3 mRNA表达量明显降低，上调miR-30a-5p可抑制MALAT1。因此我们推测MALAT1与miR-30a-5p相互作用，调控TGF-β/Smad/Cthrc1信号通路，从而影响肝纤维化发生发展。本研究将从细胞功能、临床标本、动物实验等方面探讨LncRNA-MALAT1-miR-30a-p环路影响肝纤维化发生发展的具体机制，明确MALAT1作为新靶点诊治肝纤维化的意义。

肝纤维化是一种由疤痕组织取代功能实质并严重影响肝功能和结构的愈合反应过程，其严重影响肝组织的正常生理功能，可致终末期肝病甚至死亡等严重后果。在炎症或者慢性肝损伤的过程中，静息的肝星状细胞（HSCs）激活并产生的大量细胞外基质，是肝脏发生纤维化的关键因素。然而，HSCs异常激活的作用机制尚不明确。近年来，长链非编码RNA（lncRNAs）在肝纤维化发生发展中的重要作用日益凸显，本课题旨在研究lncRNAs调控HSCs激活并诱发肝脏发生纤维化的机制。.经化学诱导（四氯化碳CCl4）及外科手术（胆管结扎）的方法，成功构建小鼠肝纤维化模型；为确证肝星状细胞的关键作用，建立并完善了小鼠原代HSC的分离培养技术；接着，取原代HSC并进行培养活化，通过高通量芯片筛选技术，比较静息与活化HSC 的lncRNAs表达情况，确证在细胞活化过程中，16816个假定的lncRNA的表达发生显著变化，进一步分析得到24条新的lncRNA；经生物信息学分析，筛选得到潜在的有效分子：lncRNA-Neat1及lncRNA-MALAT1。.通过构建慢病毒敲低或过表达lncRNA-MALAT1，发现抑制lncRNA-MALAT1的功能减弱HSC的增殖、促进凋亡以及导致细胞周期阻滞，而敲低miRNA-30a-5p不影响HSC的激活；为探索MALAT1介导HSC激活的作用机制，检测lncRNA-MALAT1对TGF-β/Smad信号通路及CTHRC1的调控情况，发现lncRNA-MALAT1能抑制CTHRC1、TGF-β/Smad信号通路效应分子Samd2/3的激活，同时miRNA-30a-5p也能抑制上述通路，而lncRNA-MALAT1与miRNA-30a-5p相互作用在介导HSC激活中的作用有待进一步研究。.进一步的，考察lncRNA-Neat1的关键作用，发现过表达该lncRNA能显著促进细胞增长；通过构建IL-6/STAT3信号通路、TGF-β/Smad信号通路、β-cantenin信号通路和Hippo信号通路的荧光素酶报告基因系统，发现lncRNA-Neat1仅激活Hippo信号通路；接着，在细胞中过表达lncRNA-Neat1，发现lncRNA-Neat1主要通过促进YAP核转位以及其下游靶基因的表达，从而激活Hippo信号通路。综上，本研究筛选并系统研究介导肝星状细胞激活的lncRNA