铝诱导八仙花柠檬酸分泌转运蛋白基因的克隆和功能分析

According to previous research, in acidic soil, aluminium ion becomes available to hydrangea roots, stimulating the hydrangea roots to exude citrates. The citrates then form complexes with aluminium ion, these aluminium citrate complexes enter the roots and are transported throughout the shrub, then detoxifying aluminium poison. Among all the cultivars, Hydrangea macrophylla cv.Coerulea has the most ability to resistant aluminium poison. Based on these researches, this project will clone citric acid secretion transport protein gene and its full-length sequence using RACE technique, we focus on analysis of amino acid sequence and physicochemical property using bioinformatics method, then align these sequences and predict its function. Spatio-temporal expression of citric acid secretion transport protein gene will analyzed by Real-Time RT-PCR and Western Blot. Finally, citric acid secretion transport protein overexpression vector will made for the transformation of tobacco, then the relationship of overexpression this gene and aluminum resistance will analyzed by handling suitable aluminum stress. After these studies, we will receive first aluminum resistance genes from hydrangea roots that will reveal the molecular mechanism of accumulating aluminum in hydrangea, and provide new material for heavy metal pollution remedy study.

据项目组前期研究发现，八仙花在铝胁迫下能吸收土壤中的铝离子，并将其运输至地上部分，以铝-柠檬酸复合物的状态富集在体内，从而消除铝毒；其中蓝色八仙花(Hydrangea macrophylla cv.Coerulea)抗铝能力最强。本课题在此研究基础上，从蓝色八仙花(H.macropylla cv.Coerulea)中克隆柠檬酸分泌转运蛋白基因，采用RACE技术克隆该基因全长cDNA，然后运用分子信息学技术分析该基因的氨基酸序列及理化性质，再进行序列比对预测基因功能；利用Real-Time RT-PCR法和Western Blot技术分析该基因时空表达特征；再构建八仙花柠檬酸分泌转运蛋白基因过量表达载体转化烟草，通过铝胁迫处理转化植株，分析该基因过量表达与植物耐铝特性的关系。本研究将获得八仙花中第一个耐铝基因，成功揭示八仙花富集铝的分子机理，为重金属污染土壤的治理研究提供新的素材。

八仙花是闻名的富集铝植物，具有很高耐铝和富集铝的能力，虽然解铝毒的生理机制及蓝色八仙花花萼中铝的重要作用已有报道，但是其耐铝和富集铝的分子机理却少见报道。本研究以八仙花扦插苗为试材，首先研究其在铝胁迫条件下根系有机酸分泌种类、耐铝能力以及影响有机酸分泌的影响因子；然后采用RNA-seq技术对根系和叶片中转录组测序分析，再将筛选出的铝响应基因进行表达分析，进行结果如下：. 1．在铝胁迫下八仙花根系分泌草酸，50μmol•L-1AlCl3处理八仙花时，根尖的铬天青染色明显，根尖伸长生长受阻显著，草酸分泌量也显著增加。铝处理后的最初4h，草酸分泌量随铝胁迫时间的延长而增加，但在4～24h内草酸分泌量并未增加。在铝溶液中加入阴离子通道抑制剂PG（10μM和20μM）和蛋白合成抑制剂CHM（25μM和50μM）后显著抑制根尖分泌草酸。说明八仙花根系分泌草酸是八仙花抵御铝毒的主要机制，而阴离子通道可能介导根系分泌有机酸。. 2. 利用RNA-seq技术对八仙花胁迫前后根系和叶片的转录组进行比较分析，获得大量差异表达的unigene序列。一共组装了平均长度为810.77bp的401,215个转录本，生成95,714个功能基因，根中4287条和叶中730条基因在铝胁迫下上调表达，根中236条和叶中719条基因则下调表达。许多转运蛋白，包括MATE和ABC家族，涉及到铝-柠檬酸复合物的转运过程，铝胁迫下质膜摄取铝的转运子Nram铝转运子在根和叶中均上调表达，在减轻铝毒中起重要作用。虽然这些基因的确切作用仍有待于进一步研究，但是本项研究结果为今后对这些基因进行功能分析提供了基础。. 项目研究结果对揭示八仙花富集铝和耐铝的生理和分子机制具有重要的意义。同时，在项目资助下，目前共公开发表论文5篇，其中 SCI 源刊论文1篇，影响因子为3.234。培养本科生3名，硕士研究生1名，圆满地完成项目预定的目标。