基于羔羊体外成熟卵母细胞转录组分析及核质成熟相关机制研究

性成熟前羔羊卵母细胞经体外成熟后，卵子核质成熟度及体外生产胚胎的发育能力非常低，制约了相关胚胎生物技术的发展。本研究拟以4-10周龄羔羊超排后获得卵母细胞为研究对象，以成年母羊卵母细胞为对照，构建体外成熟过程中的羔羊卵母细胞的RNA测序文库，利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选具有显著差异表达的基因序列，并进一步采用定量RT-PCR技术，研究这些差异表达基因在4-10周龄羔羊及成年母羊卵母细胞体外成熟过程中的表达规律，从而筛选出对羔羊卵巢卵母细胞体外成熟具有重要影响的基因。同时在细胞水平上，采用免疫组化技术分析羔羊卵子体外成熟后核质成熟度、皮质颗粒分布状况，对比研究羔羊卵母细胞受精后雌雄原核形成、体外胚胎发育率、囊胚差异染色情况及胚胎移植妊娠率。研究结果将丰富幼龄母畜卵子与胚胎发育生物学的理论基础，为开展深入研究及完善羔羊胚胎体外生产与胚胎移植技术（JIVET）体系奠定基础。

本研究就羔羊卵母细胞成熟前后进行了转录组测序，筛选相关的差异表达基因。同时，针对不同品种对羔羊超数排卵和卵母细胞发育能力的影响，对羔羊和成年羊卵母细胞核质成熟及发育潜力进行了比较研究，并在此基础上对不同品种羔羊超排方案和羔羊卵母细胞体外培养体系进行了优化和胚胎移植实验。研究结果表明：（1）实验采集羔羊成熟前后的卵母细胞并构建测序文库进行RNA-seq测序，测序结果及数据分析尚在进行中。（2）通过对不同品种羔羊超排处理，哈萨克为210.22枚，湖羊为0枚，美利奴为135.80枚，湖羊与哈萨克的杂交后代为37.80枚。湖羊羔羊和湖羊与哈萨克羊的杂交羔羊获得的平均卵母细胞数显著低于哈萨克羔羊（P<0.01；P<0.05）。（3）通过对羔羊和成年羊体外成熟期卵母细胞α微管蛋白和染色体进行免疫细胞化学染色，羔羊和成年羊卵母细胞在成熟0h和6h时大部分处于GV和GVBD期；12h时羔羊卵母细胞大部分处于GV、GVBD和MI期，而成年羊卵母细胞主要处于MI期，成年羊卵母细胞处于MI期的比例高于羔羊；18h时羔羊和成年羊卵母细胞主要处于AI-TI期，羔羊卵母细胞处于AI-TI期的比例略高于成年羊；24h时成年羊卵母细胞核成熟（处于MⅡ）率高于羔羊。成年羊卵母细胞成熟12h时有部分皮质颗粒已经迁移到质膜下，而羔羊卵母细胞皮质颗粒仍均匀分布。成年羊卵母细胞成熟24h时皮质颗粒迁移至质膜下，羔羊卵母细胞皮质颗粒没有完全迁移到质膜下，仍有大量在胞质中。说明羔羊卵母细胞核成熟和质成熟能力低于成年羊。（4）在成熟液中添加不同浓度β-巯基乙醇可以提高羔羊卵母细胞囊胚率，其中添加100μM β-巯基乙醇有显著提高（P<0.05），羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率均显著低于成年羊（P<0.05）。实验将羔羊卵母细胞体外受精获得的2-8细胞胚胎进行移植，36只受体羊中17只妊娠，妊娠率为47.22%，共产羔并存活16只。（5）检测绵羊体外受精各个发育阶段胚胎中αV及β3整合素 mRNA的表达模式及蛋白表达定位情况。结果表明，仅在绵羊囊胚期胚胎检测到αV及β3 mRNA和蛋白的表达，且蛋白表达主要分布在胚胎滋养层细胞周围，孵化囊胚蛋白表达量略高于扩张囊胚，证明αV，β3整合素在绵羊早期胚胎发育及附植过程中具有重要调控作用。研究结果将为建立高效的羔羊胚胎体外生产体系提供理论数据和实验研究基础。