FAM84B与恶性肿瘤双微体形成的相关性研究

Double minute chromosomes are cytogenetic material in tumor cells, carrying resistance genes and oncogenes, and closely related to the degree of malignancy. Currently, double minute carry genes FAM84B and dual mechanism of formation and development has not been elucidated, our study aim to focus on this research. Use double minute containing malignant cells as research platform, by RNAi, TALEN technology to knockdown or knockout FAM84B gene’ expression and detected in genomic instability and DNA damage response of different signaling pathways in cancer cells. Study on the number of double minute chromosome, the level of Double minute chromosome carried genes’ amplification and expression, micronuclei formation, DNA double strand breaks and the degree of malignancy of tumor cells changes, whereby the analysis of the involvement of different signal FAM84B tumor cells to double minute chromosomes passage formed correlation. According to the findings, by FAM84B signaling pathway and tumor cell double minute chromosomes closely related to the formation of an important target for intervention to reduce the number of double minute chromosomes, reversing the malignant phenotype of tumors for targeted therapy will double minute provide a strong scientific basis for molecular therapy of tumors.

双微体是肿瘤细胞中染色体外的遗传物质，携带癌基因及耐药基因，并与肿瘤恶性程度密切相关。目前，双微体携带的基因FAM84B与双微体形成和发展之间的机制尚未阐明，因此本研究以此为主要研究内容。利用含有双微体的恶性肿瘤细胞为研究平台，运用RNAi、TALEN手段对FAM84B基因进行差异表达，在基因组不稳定及DNA损伤应答等不同信号通路中检测FAM84B对恶性肿瘤细胞中双微体形成、携带基因扩增和表达、微核形成、DNA双链断裂及肿瘤细胞恶性程度的变化情况，由此分析FAM84B所参与的不同信号转到通路与肿瘤细胞双微体形成的相关性。根据研究结果，通过对FAM84B信号通路中与肿瘤细胞双微体形成密切相关的重要靶点进行干预，减少双微体数目，逆转肿瘤的恶性表型，针对双微体的靶向性治疗将会为肿瘤的分子治疗提供有力的科学依据。

本研究目的在于探讨FAM84B与恶性肿瘤双微体形成的相关性研究。首先通过在线数据库TCGA和R2分析FAM84B在人结肠癌组织中表达和预后情况。随后应用人结肠癌组织芯片进一步检测FAM84B在人结肠癌组织中表达情况。在线数据库CCLE分析FAM84B在多种人结肠癌细胞织的扩增与表达情况。随后在11种人结肠癌细胞株以及正常结肠细胞株中对FAM84B的表达水平进行检测。之后通过对肿瘤细胞中双微体的数目和携带基因的检测，选定既高表达FAM84B又存在双微体的人结肠癌COLO320DM和NCI-H716细胞作为研究对象。我们利用RNAi技术干扰目的基因FAM84B的表达，构建基因沉默细胞株。之后制备中期核型观察肿瘤细胞中双微体数目变化，利用Realtime PCR检测双微体上携带基因扩增情况，荧光原位杂交技术（FISH）检测微核产生情况，同时利用免疫荧光（IF）和Western blot技术检测DNA损伤情况。在细胞生物学功能方面主要利用MTS方法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡，再应用基底膜侵袭实验的方法检测细胞的侵袭能力。随后检测细胞中DNA损伤修复相关蛋白。应用表达谱芯片分析FAM84B沉默表达后，不同基因RNA转录水平变化，通过GO/KEGG富集分析，分析富集通路分子变化，并使用Realtime RT-PCR检测相关基因表达水平。我们发现，通过在线数据库TCGA和R2数据分析，FAM84B在人结肠癌组织中高表达，并影响患者的预后。人结肠癌组织芯片结果显示与癌旁组织相比，癌组织内FAM84B高表达。在COLO320DM和NCI-H716中敲减FAM84B基因后，细胞双微体数目减少，双微体携带基因的扩增水平降低，表达水平降低，同时微核排出率明显增加，DNA损伤减少，细胞功能学实验表明细胞增殖能力和侵袭能力明显降低，同时细胞周期G2/S期阻滞，细胞凋亡没有变化。DNA损伤修复相关蛋白没有变化。表达谱芯片分析发现黏附以及细胞间连接等通路发生变化，而上皮间质转化是细胞发生迁移的一个重要通路，随后通过Realtime RT-PCR验证，检测上皮间质转化相关标记物表达水平变化，发现上皮标记物E-cadherin、occludin、claudin-7表达升高，间质标记物N-cadherin、fibronectin、vimentin、twist-1表达降低。