提高生长抑素基因免疫效果的方法及其作用机制研究

克隆猪和小鼠的INF-γ、IL-12和C3d基因，插入至现有的平衡致死生长抑素真核表达质粒（pCS/2SS-asd）中，构建生长抑素基因-基因佐剂融合表达、共表达质粒，之后再插入绿色荧光蛋白（GFP）。将上述新构建的生长抑素融合表达、共表达质粒分别按照基因佐剂同源或异源的方式免疫小鼠、仔猪，通过比较分析不同生长抑素融合表达质粒在组织器官中的基因表达与分布、细胞免疫应答、体液免疫应答、细胞因子分泌及基因整合，探讨基因佐剂在生长抑素基因免疫中的作用与作用机制，同时利用分子标记手段，探讨基因免疫效果与动物个体基因型的关系。其意义在于：①提高生长抑素基因疫苗免疫效果，开发高效的促生长疫苗；②促进生长抑素基因疫苗正确、合理使用，提高应用效果；③推动其他基因免疫技术在畜牧生产和兽医临床中的应用；④探讨基因免疫效果与基因多态性的关系，不仅有助于分析基因免疫的分子机制，还可为抗病育种提供技术支撑。

本项目采用分子生物学方法克隆INF-γ、IL-12、C3d和IL-6、GM-CSF、VP22六种基因佐剂，插入至现有的平衡致死生长抑素真核表达质粒（pCS/2SS-asd）中，构建并鉴定了生长抑素基因-基因佐剂融合表达、共表达质粒。将上述新构建的生长抑素融合表达、共表达质粒免疫小鼠后，免疫组化结果表明基因疫苗肌肉注射后，主要被宿主组织（肌肉）、免疫组织（脾脏）和代谢组织（肝脏）摄取，且疫苗表达产物在肌肉组织各细胞中分布较多，成纤维细胞在免疫24 h后，就能摄取减毒沙门氏菌出现疫苗表达产物，在免疫48 h达到高峰后，免疫第5 d后成纤维细胞就未有疫苗表达产物分布。将pGS/2SS-IL-asd疫苗免疫小鼠后，发现添加佐剂的试验组免疫效果和增重效果要高于不添加基因佐剂试验组且存在一定的剂量依赖关系。将新型生长抑素共表达基因疫苗（pIRES-GM-CSF/2SS）免疫仔猪后，免疫后第30天，高剂量试验组的抗体水平为0.244，日增重比对照组提高12.83%，料重比提高3.61%。将新型生长抑素基因疫苗口服免疫仔猪后，发现免疫后仔猪行为正常，受试猪血浆中均能检测到SS抗体，高剂量免疫组（5 ×1010 CFU/只）抗体水平最高，出现的免疫阳性猪比例为40%，免疫后0～8W，仔猪平均日增T3组比对照组提高10.00%。将新型生长抑素基因疫苗鼻饲免疫仔猪后发现，随着免疫剂量的升高，平均日增重呈下降趋势，表明鼻饲免疫效果与剂量之间存在负相关关系。在日增重提升幅度一致情况下，鼻饲免疫需要的疫苗剂量远远少于口服免疫。将新型疫苗免疫仔猪后的安全性研究表明，试验猪的临床及生理生化反应均是安全性的，且具有良好的遗传稳定性。新型疫苗菌接种后能在机体内存留15d，诱导机体产生较好的免疫原性，但不会进行水平传播，也不会从猪体传播到外界环境中，同时疫苗菌及外源质粒对外界环境微生物不存在不利影响。