斑马鱼生长抑素受体6、7的发现及其免疫调节作用和机制研究

Somatostatin plays an important role on growth, reproduction and metabolization functions that are mediated by somatostatin receptors. The applicant cloned two novel somatostatin receptors, named SSTR6、7. Based on preliminary data, we hypothesized that the two receptors directly connected to the immune-related signaling pathways and involved in immune regulation, such as inflammation, activation and proliferation of Th and B cells. We designed the following experiment to confirm our conjecture. ①Analysis of the structure of sequence, evolution and expression of SSTR were performed firstly.②Using SSTR-deficient cell line, We will prove that two novel receptors are the members of somatostatin receptors family through analysises of subcellular localization and physiological characteristics of SSTR family, including inhibition of transcriptional activity of adenylate cyclase and sensitivity to pertussis toxin.③Signaling pathways mediated by the two somatostatin receptors were analyzed using luciferase reporter gene and phosphorylated antibodies in SSTR-deficient cell line.④A series of experiments in vivo and in vitro will be performed to validate the two receptors were directly involved in immune regulation through the immune-related signaling pathways.⑤The roles and mechanisms involved in immune regulation of SSTR6 and SSTR7 will be further verified in SSTR6-/-and SSTR7-/- zebrafish. The study will add novel insight into research on function and application of somatostatin receptors.

生长抑素通过其受体（somatostatin receptor, SSTR）的介导在脊椎动物的生长、发育和代谢中发挥着重要作用。通过基因组数据库SSTRs相关信息的分析，我们推测斑马鱼可能存在两种新的生长抑素受体并克隆了它们，分别命名为SSTR6、7。我们初步的实验结果提示它们可能参与免疫调节，但机制不明。为此本项目拟①分析其体内的表达模式；②通过分析它们的生理特性阐明它们是SSTR家族成员；③将它们的表达质粒转染SSTR缺陷型细胞系，利用荧光素酶报告基因和磷酸化抗体分析2种新受体介导的下游信号；④在体内、外分析SSTR6、7可能通过其介导的下游信号直接参与炎症反应,Th细胞和B细胞活化和增殖；⑤利用SSTR6-/-和SSTR7-/-缺陷的斑马鱼进一步验证两种受体参与免疫调节的作用和机制。本项目将给脊椎动物SSTR的功能研究以及水产行业生长抑素相关的应用研究提供新视野和科学依据。

在本研究中，从斑马鱼克隆了2种鱼类特有的新受体，命名为zfSSTR6和zfSSTR7，序列结构，进化分析都表明新克隆的受体是SSTR家族的成员。SSTR6和SSTR7广泛分布在中枢神经系统和外周组织，暗示它们可能参与多个组织的多种调节作用。信号通路分析表明,zfSSTR6和zfSSTR7能够和SS14结合并参与AC/cAMP/PKA，PKC和ERK1/2 的调节，此外zfSSTR6还参与NFKB通路的调节。这个结果暗示zfSSTR6和zfSSTR7可能在内分泌调控中参与多重调节。在体内外，灭活的V.a 处理能够上调SSTR6及SS14的转录水平，暗示SS14，SSTR6可能参与免疫调节。在体外培养的白细胞中, SS14能显著抑制Th和B细胞活化指标的转录水平。AC/cAMP/PKC，IP/PLC/PKC，ERK1/2和NFKB通路信号通路抑制剂的能够部分加强或解除SS14对Th和B细胞活化指标的转录水平的抑制。这个结果暗示SSTR（包括zfSSTR6和 zfSSTR7）可能通过这些通路参与对Th和B细胞活化的调节。基因敲除SSTR6不影响斑马鱼肝，脑和脾脏多个基因的本底水平的表达，但灭活的V.a处理后，和野生型相比脾脏内多个免疫相关基因均发生显著的改变。该结果进一步支持zfSSTR6参与免疫调控的观点。.为了弥补新克隆的基因仅在一个物种存在的不足，我们在翘嘴红鲌中也克隆了两个新受体，EISSTR6和EISSTR7，并对其序列结构，表达模式，结构和功能关系以及内分泌干扰物对它们表达的影响做了研究。该研究进一步证实鱼类存在两种特有的功能性受体SSTR6和SSTR7。此外，基因敲除显示SSTR6可能参与的硒蛋白的调节，这个结果让我们很意外，我们进一步在翘嘴红鲌中证实SS14能够调节硒蛋白W的转录，且和性激素相关，该研究暗示SSTR6除了参与免疫的调节还可能参与生长生殖相关的调节。本研究给脊椎动物SSTR的进化和功能研究带来补充以及水产行业生长抑素相关的应用研究提供新视野和科学依据。