一个新克隆的microRNA对动脉钙化的调控机制研究

血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨细胞表型分化是动脉钙化的细胞学基础。在前期研究中，我们首次克隆了一个新的microRNA（暂称为miR-X），并证实：随着VSMCs向成骨细胞表型分化，miR-X的表达逐渐下调。采用生物信息学分析，我们预测其靶基因可能是调控成骨细胞分化的RUNX2。本课题拟在前期研究的基础上，首先通过体外细胞实验，探讨低表达和过表达miR-X对血管平滑肌细胞向成骨细胞表型分化的影响。并采用荧光报告基因策略、RNA干扰等分子生物学方法来验证miR-X的靶基因，明确miR-X的作用机制。然后通过动物体内实验，合成microRNA抑制剂，建立特异性miR-X缺失的小鼠模型，观察在维生素D的诱导下动脉钙化发生的情况。本研究分别从分子、细胞和动物实验水平，探讨miR-X对动脉钙化的调控机制，将为动脉钙化的防治提供新的理论基础和防治靶点。

通过本研究，我们探讨了两种miRNAs和四种细胞因子参与血管平滑肌细胞成骨样分化的调控机制。首先，我们根据预测选定了两个Runx2的靶miRNAs：miR-133a 和miR-204。体外实验发现，诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程中，miR-133a和miR-204的表达均下调。采用两者的拮抗剂（atagomirs）沉默相应miRNAs，可抑制血管平滑肌细胞碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌、Runx2表达和矿化结节形成，证实miR-133a和miR-204可抑制血管平滑肌细胞的钙化。采用Runx2的siRNA抑制其表达后，miR-133a和miR-204拮抗剂的促血管平滑肌细胞钙化作用被逆转。通过荧光素酶报告基因进一步证实，Runx2是两者的直接靶基因。此外，在昆明鼠体内注射miR-204激动剂（agomir）也可以抑制维生素D3诱导的动脉中层钙化。.另外，基于本项研究，我们尝试勾勒出相对综合的一个分子网络。在该网络中，牛磺酸(taurine)、左卡尼汀(L-carnitine)、apelin以及ghrelin显示出对血管平滑肌细胞成骨样分化的抑制作用。我们发现，taurine通过TAUT/ERK信号通路来恢复Axl/Gas6的作用，apelin则通过APJ/PI3-K/Akt信号通路来抑制凋亡，而ghrelin也经ERK依赖性通路来发挥其抑制血管平滑肌细胞钙化的效应。除此之外，L-carnitine与taurine对抑制血管平滑肌细胞的增殖和成骨样细胞分化具有协同效用。此外，我们还证实主动脉瓣基质细胞可以被自制的促钙化培养基诱导为成骨样表型，并且牛磺酸会通过ERK通路来削弱这一病变过程。