酶促立体可调控一步合成双手性中心化合物方法及其调控机理

It is very important for stereoselective complex organic synthesis to develop enzymatic synthesis strategy with higher and easily controllable stereoselectivity, which can be used for one-step synthesis of optically pure compounds with several chiral centers. This project mainly focuses on the rational redesign of the alcohol binding pocket and acyl binding pocket of CALB, and attempts to construct CALB mutants with high stereoselectivity for both alcohol and acid substrates, and then will use these mutated CALB for the synthesis of optically pure compounds with double chiral centers. It is possible to control the stereoselectivity for the four possible enantiomers respectively, through the suitable combination between the two selectivity of CALB for alcohol and acid substrate. This project also plans to explore the relationship between the structure of CALB mutants and their stereoselectivity, and provide some knowledge about how the mutated amino acids influence the selectivity of CALB. Furthermore, simultaneous dynamic kinetic resolution of alcohol and acid moieties of the ester with two chiral centers will be investigated, and used for the synthesis of an important chiral drug model. The obtained results of this project will be useful for the development of more efficient, more atom economical and greener enzymatic synthesis, and have important application potentials in the fields of biocatalysis and organic synthesis.

发展选择性更好的酶促方法，特别是能够有效地调控选择性、并能一步合成具有多手性中心化合物的方法，对于复杂有机手性合成而言至关重要。项目主要通过对CALB脂肪酶的酸和醇结合口袋进行蛋白质工程改造，构建同时对酸和醇都具有高选择性的活性位，实现一步拆分醇和酸两个手性中心，制备单一构型的双手性中心化合物；并通过对酸和醇底物选择性的不同组合，有效地实现在4种可能的产物构型间自由调控；探索CALB脂肪酶结构与立体选择性之间的关系，深入认识酶结构对催化立体选择性的影响规律；建立酸和醇同时动态动力学拆分的方法，并利用该方法合成重要的双手性中心药物分子。本项目的研究有助于建立更加高效、绿色和原子经济性的酶促合成新方法，为制药工业和精细化工领域的立体选择性合成方法提供更好的酶催化剂积累基础，在生物催化和有机合成相关领域有重要的应用前景。

利用定向进化技术调控酶的立体选择性，特别是发展在多手性中心的反应中能实现每种手性选择性控制的高效酶催化剂，对于复杂手性合成而言至关重要。本项目围绕原定研究要点，完成了以下五部分的研究内容。第一部分实现了CALB定向进化对醇手性选择性的调控。野生型CALB脂肪酶对仲醇具有很高的R-构型选择性，而我们通过对CALB的醇口袋几个关键氨基酸的突变，获得了一系列具有高（S）-构型选择性的突变株，其选择性比已报道的突变株要好很多，进一步将CALB突变株应用于Morita−Baylis−Hillman（MBH）醇的动态动力学拆分，首次实现了R-和S-选择性定制的无金属催化MBH仲醇的动态动力学拆分（DKR）反应。第二部分实现了CAL-B定向进化对酸手性选择性的调控。从通过氨基酸残基体积扫描的方法构建的一个高度聚焦小库中筛选得到了能有效调控CALB对酸立体选择性的突变株。第三部分建立脂肪酶一步拆分合成含醇酸双手性中心的酯化合物的新方法。我们通过理性设计，高效筛选获得了4类CALB突变株，分别可以实现对双手性酯合成反应中RR、RS、SR和SS等4种选择性的有效控制，其中三类突变株都具有广阔的底物谱，另外还实现了双手性酯合成反应中动态动力学的过程。在第四部分的扩展研究中，我们建立了双手性选择性的突变株催化的平行动力学拆分新方法，在一锅反应中催化外消旋酸底物的2个对映异构体分别与2种不同结构的外消旋醇底物发生拆分反应，可以一步反应得到4种手性化合物。在第五部分研究中，我们共获得了8个CALB突变株的蛋白晶体结构，通过结构分析和模拟计算探讨了这些突变株的选择性机理。经过四年努力，基本完成了预定的研究任务，已在Adv. Synth. Catal.，ACS Catal.等期刊上发表SCI论文7篇，撰写外文专著1章，在PDB上报道CALB晶体结构8个，在国内外会议上做口头报告6篇。本研究有助于为手性合成提供更好的酶催化剂，在相关领域有重要的应用前景。