Si-CaP/自体微小颗粒骨/BMSCs组织工程骨的体外构建和体内研究

Spinal fusion has been widely used in the treatment of spinal diseases.Autogenous bone graft is generally recognized as the gold standard to spinal fusion. However , the nonunion incidence rate in sigle level spinal fusion remains 5%～35% in clinical cases .For this reason, seeking a better way to improve spinal fusion rate and enhance successful spinal fusion outcome has been an essential topic to the orthopaedic surgeon. In the past few years, with the development of tissue engineering technology , finding new solutions to avoid nonunion became feasible. This study will focus on the construction of silicate substituted calcium phosphate（Si-CaP）/autogenous tiny morselized bone scaffold,which possesses osteoinduction,osteoconduction and osteogenesis. The scaffold will be combined with the cultivative bone marrow stromal cells （BMSCs）into New Zealand rabbits. The adhesive and proliferative effectiveness of Si-CaP/autogenous tiny morselized bone scaffold on BMSCs and it's inductive influence on BMSCs to osteoblast transformation will be observed in vitro as well. Using New Zealand rabbit spinal fusion model , the scaffold with BMSCs will be placed bilaterally in the region spanning L5-L6 transverse processes. Gross observation , histomorphological examination, biomechanics detection, radiology examination and molecular biology method will be applied to investigate the outcome of spinal fusion and the fate of the BMSCs in vivo. This study will definitely provide a new experimental foundation and theoretical basis to improve the successful rate of spinal fusion in clinical practice.

脊柱融合广泛应用于脊柱外科疾病的治疗过程中。虽然自体骨是公认的促进脊柱融合的金标准，但仍会导致5%～35%单节段脊柱融合的患者发生不融合。寻求提高脊柱融合率和促进脊柱融合的方法成为骨科医生面临的重要课题。近年来，随着组织工程技术的发展，为解决脊柱不融合的问题提供了新的思路。本实验通过构建新型的同时具有骨诱导性、骨传导性和骨生成作用的硅磷酸钙（Si-CaP）/自体微小颗粒骨支架载体，并与新西兰兔骨髓基质细胞（BMSCs）复合培养，体外观察Si-CaP/自体微小颗粒骨支架载体对BMSCs的粘附和增殖的影响以及其诱导BMSCs向成骨细胞转化的作用。而后，将Si-CaP/自体微小颗粒骨/BMSCs组织工程骨植入新西兰兔脊柱融合的动物模型中，通过大体观察、组织学观察、生物力学检测、影像学检测、分子生物学等方法研究脊柱融合情况和BMSCs在体内的转归情况。为进一步将其应用于临床提供实验基础和理论依据。

目的：将BMSCs与Si-CaP/自体微小颗粒骨支架载体复合，观察BMSCs在支架载体上的生长情况，评价该支架载体诱导BMSCs向成骨细胞转化的能力。将BMSCs/Si-CaP/自体微小颗粒骨组织工程骨植入兔脊柱融合的动物模型中，观察其对兔脊柱融合的作用并观察BMSCs在体内的转归情况。方法：将分离、培养的新西兰兔BMSCs与Si-CaP/自体微小颗粒骨支架载体复合，CCK-8法检测BMSCs增殖情况，HE染色、扫描电镜观察细胞在支架载体中的形态和分布，并应用CM-Dil标记BMSCs；RT-PCR测定各组复合培养后BMP-2、TGF-β1、ALP、BSP、OPN、OCN、COL-I的mRNA表达情况；免疫组化法检测OPN表达情况。将BMSCs与Si-CaP/自体微小颗粒骨复合制备的组织工程骨，植入兔后外侧脊柱融合动物模型中，通过大体观察、手触力学检测、生物力学检测、X线、CT三维重建、Micro-CT、HE染色、扫描电镜、组织学定量分析、荧光骨标记检测、ELISA检测等方法，观察脊柱融合情况和BMSCs在体内的转归情况。结果：BMSCs在支架载体中均匀分布，生长良好，增殖曲线明显，粘附率高达82%；CM-Dil标记的BMSCs，标记率达95%；RT-PCR结果显示，随着时间延长，各组因子mRNA表达逐渐升高，Si-CaP/自体微小颗粒骨支架载体促进BMSCs向成骨细胞分化的能力明显；免疫组化检测中BMSCs/Si-CaP/自体微小颗粒骨组织工程骨OPN呈阳性表达；大体观察、手触力学检测、生物力学检测、X线、CT三维重建、Micro-CT、HE染色、扫描电镜、组织学定量分析、荧光骨标记检测、ELISA检测结果显示，BMSCs/Si-CaP/自体微小颗粒骨组织工程骨组随时间延长，移植材料逐渐降解吸收，术后12周可见移植区域骨性融合，各时间点成骨效果与自体骨组无显著差别；各时间点植骨区域内见大量散发红色荧光的细胞，新生骨组织中也见红色荧光表达。结论：本实验构建的Si-CaP/自体微小颗粒骨支架载体具有生物学活性，能够促进BMSCs向成骨细胞转化；BMSCs/Si-CaP/自体微小颗粒骨组织工程骨应用于脊柱融合的动物模型中，发挥了骨诱导、骨传导和骨生成作用，在减少自体骨用量的前提下提高了脊柱融合率并缩短了脊柱融合时间；标记的BMSCs参与脊柱融合的各个阶段并发挥成骨作用。