microRNA介导ADAR1抑制流感病毒复制的研究

越来越多的研究结果表明RNA编辑酶ADAR1可以调控病毒在细胞内的复制过程，但其调控机理尚不清楚。根据对文献的综合分析及本课题的前期研究结果，我们提出了microRNA介导ADAR1调控病毒复制的假说：病毒感染后，细胞为了对抗病毒的入侵会产生干扰素α，干扰素α进一步诱导细胞表达分子量为150KDa的ADAR1蛋白（ADAR1-L） ，过量表达的ADAR1-L会增加对microRNA前体pri-miRNA的编辑强度，这种编辑作用会导致microRNA表达水平或者生物学功能发生变化，最终改变细胞对抗病毒的能力。本项目从假说出发，以流感病毒作为研究对象，综合利用各种生物学技术手段寻找microRNA介导ADAR1抑制流感病毒复制的分子生物学证据。通过本项目的实施不但可以丰富细胞对抗病毒的分子生物学理论，而且还可以为人类研发防治流感病毒的小分子药物奠定理论基础。

ADAR1是一种RNA编辑酶，在细胞的许多生命活动过程中扮演了重要的角色，通过本项目研究证实ADAR1可以通过调控miRNA的表达水平显著抑制H1N1型流感病毒在宿主细胞中的复制过程。通过miRNA芯片技术和real-time PCR技术证实在宿主细胞中过表达ADAR1会使miR-491-5p的表达水平显著上调；血凝实验结果显示，miR-491-5p可以显著抑制流感病毒在宿主细胞中的复制过程；通过基因克隆技术构建pri-miR-491的表达载体；基因测序结果表明ADAR1可以编辑pri-miR-491的核酸序列；利用碱基突变技术制备编辑后的pri-miR-491的表达载体并将该载体转入细胞中，miRNA定量分析结果表明，突变后的pri-miR-491可以剪切加工成更多的miR-491-5p的成熟序列；同时，Western blot技术和real-time PCR研究表明miR-491-5p可以在蛋白水平和mRNA水平上均下调流感病毒蛋白PB1的表达水平；RNA杂家技术显示miR-491-5p在pb1基因上的作用位点在不同种类的流感病毒中均高度保守；通过碱基突变技术和反向重组技术构建不含有miR-491-5p作用靶点的突变型H1N1流感病毒毒株，血凝实验结果表明ADAR1和miR-491-5p均不能在抑制病毒的复制过程。本项目的一系列研究结果表明ADAR1可以通过对miRNA前体的编辑作用来调控成熟miRNA的表达水平，从而介导了对流感病毒复制的调控作用。通过本项目的顺利实施为细胞免疫病毒提供了一条崭新的信号调控通路，为新型流感药物的研发奠定了理论基础。.本项目的顺利实施取得了丰硕的学术成果。其中研究结果已经申请了国家专利一项，并在J.viro、cell microbiology以及微生物学报上面各发表文章一篇，还有部分研究结果正在整理中；另外，本项目的实施为国家培养了中青年学术带头人1名，博士后1名，博士研究生1名，硕士研究生2名；此外，在执行本项目的过程中，项目负责人参加了国际会议2次，通过与同行专家的交流在业务上有了很大的进步。