嗜盐四联球菌胁迫应答分子机制及其在酱油酿造中的应用研究

Soy sauce fermentation is a dynamic process of stresses, including changing salinity, temperature, pH and osmotic pressure. As the major lactic acid bacteria (LAB) contributing to the formation of soy sauce flavor, Tetragenococcus halophilus adjusts to various stresses produced by fermentation mainly through the molecular chaperone and protease system. This project focuses on the stress response mechanisms of molecular chaperones and proteases from T. halophilus at the DNA, RNA, and protein levels, respectively; accordingly generates new strains with genetic manipulation methods to explore their applications in soy sauce brewing. To investigate the negative regulation of the dnaK, groESL, and shsp operons, exerted by HrcA/CIRCE, gene knockout, quantitative PCR, protease activity analysis are employed; with size exclusion chromatography, Western blotting, protein renaturation technology, the interaction mechanisms of ClpB/ClpP/DnaK are deliberated; the relationship between the molecular chaperone system and the glycine betaine transport system are clarified by means of expression analysis of hrcA, dnaK and butA mRNA and protease activity under stresses, as well as the effect of knockout of hrcA on the expression of butA; apply mutation strains to soy sauce brewing with genetic engineering approach, which lays a solid foundation to improve the quality and safety of soy sauce.

酱油发酵是盐度、温度、pH和渗透压等胁迫压力不断变化的动态过程，嗜盐四联球菌作为促成酱油风味形成的主要乳酸菌，主要通过其分子伴侣及蛋白水解酶系统应对发酵过程所产生的胁迫压力。本课题将从DNA、RNA、蛋白质等水平上深入研究嗜盐四联球菌分子伴侣及蛋白水解酶系统的胁迫应答机制，并据此遗传改造新菌种，探讨其在酱油酿造中的应用。采用基因敲除、荧光定量PCR、蛋白酶活性测定等方法，研究HrcA/CIRCE对dnaK、groESL、shsp操纵子的负调控作用；借助尺寸排阻色谱法、免疫印迹、蛋白复性等技术，揭示ClpB/ClpP/DnaK的相互作用机制；通过胁迫表达分析hrcA、dnaK、butA mRNA和蛋白酶活性，以及敲除hrcA对butA的表达影响，阐明甜菜碱运输系统与分子伴侣系统的相互关系；结合基因工程筛选突变菌种，应用于酱油酿造，为提高酿造酱油的品质和安全性奠定坚实基础。

项目的背景及其科学意义：.酱油发酵是盐度、温度、pH和渗透压等胁迫压力不断变化的动态过程，嗜盐四联球菌作为促成酱油风味形成的主要乳酸菌，主要通过其分子伴侣及蛋白水解酶系统应对发酵过程所产生的胁迫压力。本课题从DNA、RNA、蛋白质等水平上深入研究嗜盐四联球菌分子伴侣及蛋白水解酶系统的胁迫应答机制，阐明甜菜碱运输系统与分子伴侣系统的相互关系，结合基因工程筛选突变菌种，应用于酱油酿造，为提高酿造酱油的品质和安全性奠定坚实基础。.主要研究内容：.（1）嗜盐四联球菌CICC 10469盐胁迫应答机制的比较转录组学研究；.（2）双拷贝嗜盐四联球菌butA的异源表达对大肠杆菌耐盐性的影响研究；.（3）嗜盐四联球菌中与耐盐相关新型基因特性的研究。.重要结果和关键数据：.（1）当T. halophilus处于较低盐浓度下时，主要通过高表达一些与转录、翻译、膜系统和细胞分裂相关的基因进行盐适应性调控，这些基因编码核糖体蛋白、核糖体结构成分，或涉及核糖体的生物合成、核糖激酶活性、tRNA二氢尿苷的生物合成、甘油酯代谢、脂质A和脂肪酸生物合成等；当T. halophilus处于较高盐浓度下时，主要通过高表达一些与热激蛋白（HSPs）和ABC转运系统相关的基因进行盐胁迫应答调节，如基因grpE，groES，clpE，hslV，hslU，hrcA，dnaK，groEL，rpoD，TEH_05170，TEH_05190，TEH_17310等。同时，还发现大量功能不明确的新异基因在盐胁迫下出现了显著性表达。.（2）butA的表达受到盐调控，双拷贝butA 完整表达盒能提高大肠杆菌MKH13的耐盐性，这表明多拷贝butA完整表达盒应用于嗜盐四联球菌基因工程改造以提高其耐盐性有一定的潜力，同时为嗜盐四联球菌的进一步研究和工业应用打下了良好基础。.（3）嗜盐四联球菌存在许多有可能参与盐胁迫相关的基因，其中大部分功能未知。其中的TEH_05770基因是嗜盐四联球菌盐胁迫耐受性的一个相关基因，并且该基因可以在异源宿主菌中进行表达，通过表达可以提高异源宿主菌的盐胁迫耐受能力，这对以后进行工业微生物提高盐耐受性的改造提供了有效的途径。