基于PI3K/AKT信号通路的下游关键分子mTOR、mdm2研究针刺对缺氧缺血性脑病的干预机制

Established Hypoxic-ischemic encephalopathy model in immature rats by Ligating unilateral carotid artery in hypoxic condition,with the neurological grading, pathology, electron microscopy, brain slice production,fluorescence quantitative RT-PCR assay,Western-blotting ,hypoxia ischemia rats were observed in periods of1d, 7d, 14d, 21d, as well as interactions between pro-apoptotic gene MDM2 and translation initiation gene mToR which two downstream key molecular in PI3K / AKT signal transduction pathway of lateral cortical brain tissue and correlation of synaptic ultrastructure changes.Modulatory function on above factors caused by acupuncturing points of Du Meridian "Baihui" ,"Dazhui","Quchi" and "Yongquan" was watched,which drew the scientific hypothesis that"one of the mechanism of hypoxic ischemic encephalopathy treatment is that start PI3K / AKT-mTOR pathway and inhibition apoptosis gene MDM2 by acupuncture as to promote synapse reconstruction" and discussed it systematically.

以结扎单侧颈总动脉并置于低氧气体中建立缺氧缺血性脑病大鼠的幼鼠模型，采用神经学分级评定、病理学、电镜、脑片制作、荧光定量RT-PCR检测、蛋白免疫印迹Western-blot检测等技术，观察缺氧缺血后1d、7d、14d、21d等不同时间段幼鼠整体行为、缺氧缺血侧脑组织皮层PI3K/AKT信号转导通路中两个下游关键分子促凋亡基因mdm2和翻译起始基因mToR的相互作用规律以及与突触超微结构动态变化的相关性。观察针刺"百会"、"大椎"、"曲池"、"涌泉"四穴对以上指标的调节作用，归纳提出"针刺启动PI3K/AKT-mTOR通路并抑制mdm2凋亡基因从而促进突触重建是治疗缺氧缺血性脑病的作用机制之一"的科学假说，并进行系统探讨。

新生儿缺氧缺血性脑病是危及新生儿生命和导致小儿神经损伤的主要原因之一。寻找有效的防治手段并阐述其机理研究仍然是神经科学领域的重要课题。缺氧缺血性脑损伤后，神经胶质细胞可释放多种营养因子，在神经细胞的发育、突触重建和脑的可塑性方面发挥着重要的作用。其中，PI3K/AKT信号通路是调控细胞生存的最关键的信号通路之一。本课题选用SPF级7日龄SD大鼠共340只，假手术组25只，将剩余315只幼鼠按照Rice的方法并加以改进，结扎双侧颈总动脉，建立HIE模型，将造模成功的183只幼鼠按照区组随机法分为模型组、假电针组、电针组、拮抗剂组、针刺加拮抗剂组，每组又分为1d、3d、7d、21d四个亚组，每组约36只。针刺组采用电针治疗，针刺“百会”、“大椎”“曲池”、“涌泉”穴。采用大鼠运动功能缺损评分，HE染色观察缺氧缺血侧脑组织病理学变化；透射电镜观察脑组织超微结构；RT-PCR检测mTOR mRNA、mdm2 mRNA转录水平变化；Western-blot法检测mTOR、mdm2蛋白表达变化。结果发现(1) 缺氧缺血性脑损伤后，幼鼠神经病理形态变化、神经元超微结构有向好发展的趋势，但这种变化只持续较短一段时间，且脑损伤的修复能力有限。(2)缺氧缺血性脑损伤后，随着电针治疗时间的延长，电针能够促进mTOR的表达呈持续上升状态，对脑损伤后发挥保护作用。说明电针对缺氧缺血性脑损伤大鼠治疗时间越长，疗效越好，为新生儿缺氧缺血性脑病的针灸干预治疗提供实验学依据。(3)缺氧缺血性脑损伤后，随着电针治疗时间的延长，电针能够下调mdm2的表达呈持续下降状态，对脑损伤后发挥保护作用。该实验结果为"针刺启动PI3K/AKT-mTOR通路并抑制mdm2凋亡基因从而促进突触重建是治疗缺氧缺血性脑病的作用机制之一"的科学假说提供实验理论学依据。