重组腺病毒介导Raf基因持续激活Erk1/2/Merk信号通路修复脊髓损伤的机制研究

Axonal regeneration after spinal cord injury has been a worldwide problem. Our previous study found that activation Erk1/2/Merk signaling pathway can promote axonal regeneration after spinal cord injury, but the mechanism is not clear. According to the literature, Raf gene can activate Erk1/2/Merk signaling pathway. Therefore, we hypothesized that activation of Raf gene may active Erk1/2/Merk signaling pathway to promote repair injured spinal cord. To confirm this hypothesis, and explore the mechanism of action Erk1/2/Merk signaling pathway in the spinal cord injury, we isolated spinal motor neurons and astrocytes in vitro using recombinant adenovirus-mediated gene activation of Raf Erk1/2/Merk signaling pathway, to observe the effect of spinal cord cell development; We created the animal models of spinal cord injury , respectively, using adenovirus transfection of Raf gene to activate Erk1/2/Merk signaling pathway or inhibit by injecting U0126 , in order to explore the functional recovery and axonal regeneration after spinal cord injury in mice , to reveal the mechanism of nerve regeneration by sustained activation of Erk1/2/Merk pathway in animal models of spinal cord injury. This research can provide a new direction for basic research and clinical drugs development of spinal cord injury.

脊髓损伤后神经轴突再生一直是世界性难题。我们前期研究发现激活Erk1/2/Merk信号通路可促进脊髓损伤后神经轴突的再生,但其机制尚不明确。根据文献报道，Raf基因可以激活Erk1/2/Merk信号传导通路。因此，我们推测Raf基因可能具有激活Erk1/2/Merk信号通路促脊髓损伤修复的作用。为证实这一假说，探讨Erk1/2/Merk信号通路在脊髓损伤中的作用机制，我们在体外分离脊髓运动神经细胞和星形胶质细胞，利用重组腺病毒介导Raf基因激活Erk1/2/Merk信号通路,观察对脊髓细胞发育的影响; 并利用脊髓损伤的动物模型，分别予腺病毒转染Raf基因激活或注射U0126抑制Erk1/2/Merk信号通路，观察动物模型的功能恢复和轴突再生情况，揭示通过介导Raf基因持续激活Erk1/2/Merk信号通路对脊髓损伤神经再生的作用机制，为脊髓损伤基础研究和临床药物开发提供理论基础和研究方向。

为研究Raf/Erk1/2/Merk信号传导通路在脊髓损伤后的病理机制，通过培养脊髓运动神经细胞和脊髓星形胶质细胞，对该信号通路的机制进行探索。建立脊髓损伤的动物模型，应用信号通路抑制剂，观察脊髓损伤后功能恢复和轴突再生，探讨该信号通路对动物模型脊髓损伤后神经再生的作用机制。体外实验中利用腺病毒携带绿色荧光蛋白（Ad-GFP）和Raf-1蛋白（Ad-Raf1）感染脊髓运动神经元和星形胶质细胞，观察细胞粘附和迁移能力的变化，通过免疫组化、Western-blot、RT-PCR和细胞电生理技术观察该信号通路上调后对脊髓运动神经元和星形胶质细胞的发育的影响。并将两种细胞共培养，观察该信号通路上调后两种细胞之间的相互作用。体内实验中，利用抑制剂U0126，观察该信号通路抑制后对脊髓损伤神经修复的作用。升高的信号水平促进脊髓运动神经细胞和胶质细胞的迁移能力，但是阻碍神经细胞的突触形成，抑制神经细胞的树突向成熟分化的能力。随着Raf/ERK/Merk信号水平的升高，促进了星形胶质细胞的发育和成熟。与星形胶质细胞共培养后, 脊髓运动神经元突触标志物增加并出现成簇现象, 轴突和树突也进一步分化, 突触的数目较对照组增加了7倍（p<0.001）。体内实验中，U0126组神经功能恢复明显好于对照组，两组间有统计学意义(p<0.05)。免疫组化及BDA染色结果显示U0126组有较多的再生神经纤维通过损伤区，而脊髓损伤组和非手术组几乎未见再生神经纤维穿越。免疫组化染色显示U0126组损伤空洞明显小于其余两组（p<0.05）。电生理学检测结果发现与对照组相比，U0126组潜伏期延长(p<0.05)，动作电位幅度增高(p<0.05)，长时程动作电位明显增加（P<0.01）。Raf/Erk1/2/Merk信号水平升高损伤脊髓神经细胞的发育并造成神经信号传导不平衡，同时刺激胶质细胞增生并分泌多种神经诱导因子，促进共培养早期脊髓神经细胞成熟，为临床治疗脊髓损伤时间点选择提供理论依据。抑制该信号通路可以促进动物模型的功能恢复、轴突再生以及电生理学改善，此结果证明Raf/Erk1/2/Merk信号通路在脊髓损伤的修复过程中发挥着重要作用，为脊髓损伤基础研究和临床治疗提供新的方向。