TWEAK-Fn14调控Erk1/2/Merk启动脊髓运动神经元内源性再生及修复脊髓损伤的作用机制研究

Axonal regeneration and functional synapses connection are still the main challenge after spinal cord injury. Regenerating fibres could have sprouted from residual spinal cord in the damaged segments,but there is as yet little information on the nature of the terminations of such regenerating fibres and whether they make synapses. So, the only way to solve the problem is ignite the inner regeneration procedure. Our previous study found that the inhibition of Erk1/2/Merk signaling pathway can promote axonal regeneration of injured spinal cord and rebalance the exciting-inhibition signal in cells. Moreover, according to the literature, Erk1/2/Merk signaling pathway can be regulated by TWEAK-Fn14,which also found involved in the. however, the underlying mechanisms remain poorly understood. Therefore,we were replicated in vitro and vivo models of spinal cord injury. In vitro we use a adenovirus transfection TWEAK-Fn14 gene to regulate the Erk1/2/Merk signaling pathway, and observe the influence on the development of the spinal cord motor neurons and astrocytes of injured spinal cord by using two-photon, molecular biology, confocal microscopy, patch-clamp techniques after the Erk1/2/Merk signaling pathways activated, to explore the functional recovery and axonal regeneration after spinal cord injury in mice. This research can provide a new direction for basic research and clinical drugs development of spinal cord injury.

脊髓损伤后长轴突再生和功能性突触的建立仍然是一个主要挑战。其病理机制研究不清导致治疗困难。我们前期研究发现损伤后神经细胞的内部兴奋-抑制信号失衡，通过改善信号失衡后能有效促进神经轴突的再生和树突功能的改善，而目前研究发现，Erk1/2/Merk信号通路的上游调控基因TWEAK-Fn14，参与细胞内源性再生启动程序，但具体的激活及诱导机制尚不清楚。本研究拟建立细胞模型和动物模型，利用TWEAK-Fn14调控Erk1/2/Merk信号通路，改善神经细胞内部信号失衡状态的同时，揭示激活脊髓神经元内源性再生程序的内在规律，利用双光子显微镜，动态观察细胞和动物模型神经轴突再生，电生理监测树突功能的改善情况，明确TWEAK-Fn14调控Erk1/2/Merk信号通路启动脊髓神经元内源性再生的机制，寻求建立更加可靠有效的细胞激活策略，为实现脊髓损伤的有效修复和早期康复创造条件。

研究TWEAK-Fn14/Erk1/2/Merk信号传导通路在脊髓损伤后的病理机制，培养脊髓运动神经细胞和脊髓星形胶质细胞，对该信号通路的机制进行探索。建立脊髓损伤的动物模型，应用信号通路抑制剂，观察脊髓损伤后功能恢复和轴突再生，探讨该信号通路对动物模型脊髓损伤后神经再生的作用机制。体外实验中利用腺病毒携带绿色荧光蛋白（Ad-GFP）、TWEAK蛋白（Ad-TWEAK）、Ad-TWEAK siRNA和Ad-Fn14 siRNA感染脊髓运动神经元和星形胶质细胞，观察细胞粘附和迁移能力的变化，通过免疫组化、Western-blot、RT-PCR和细胞电生理技术观察该信号通路上调后对脊髓运动神经元和星形胶质细胞的发育的影响。并将两种细胞共培养，观察该信号通路上调后两种细胞之间的相互作用。体内实验中，利用TWEAK抑制剂，观察该信号通路抑制后对脊髓损伤神经修复的作用。升高的信号水平促进脊髓运动神经细胞和胶质细胞的迁移能力，但是阻碍神经细胞的突触形成，抑制神经细胞的树突向成熟分化的能力。随着TWEAK-Fn14/ERK/Merk信号水平的升高，促进了星形胶质细胞的发育和成熟。与星形胶质细胞共培养后,脊髓运动神经元突触标志物增加并出现成簇现象,轴突和树突也进一步分化,突触的数目较对照组增加了7倍（p<0.001）。体内实验中，TWEAK抑制剂组神经功能恢复明显好于对照组，两组间有统计学意义(p<0.05)。免疫组化及BDA染色结果显示TWEAK抑制剂组有较多的再生神经纤维通过损伤区，而脊髓损伤组和非手术组几乎未见再生神经纤维穿越。免疫组化染色显示TWEAK抑制剂组损伤空洞明显小于其余两组（p<0.05）。电生理学检测结果发现与对照组相比，TWEAK抑制剂组潜伏期延长(p<0.05)，动作电位幅度增高(p<0.05)，长时程动作电位明显增加（P<0.01）。TWEAK-Fn14/Erk1/2/Merk信号水平升高损伤脊髓神经细胞的发育并造成神经信号传导不平衡，同时刺激胶质细胞增生并分泌多种神经诱导因子，促进共培养早期脊髓神经细胞成熟，为临床治疗脊髓损伤时间点选择提供理论依据。抑制该信号通路可以促进动物模型的功能恢复、轴突再生以及电生理学改善，此结果证明TWEAK-Fn14/Erk1/2/Merk信号通路在脊髓损伤的修复过程中发挥重要作用，为脊髓损伤基础研究和临床治疗提供方向。