ShERF1b转录因子调控甘蔗蔗糖积累的分子机理

Sugarcane is an important worldwide sugar crop in tropical and subtropical fields. The regulation mechanisms on sucrose accumulation in sugarcane culms is always the researches focus for sugarcane. It shows that AP2/ERF transcription factors (TFs) regulate sucrose accumulation in plants. Previous studies have showed that many AP2/ERF TFs were down regulated in mature high sucrose accumulation internodes except for ShERF1b which was up regulated in mature high sucrose accumulation internodes. It speculated that ShERF1b might be the positive regulator for sucrose accumulation in sugarcane clums. However, the regulatory mechanisms of ShERF1b on sucrose accumulation are still unclear. In this project, the binding promoters and target genes of ShERF1b will be isolated by Chromatin immunoprecipitation technique and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The key target gene of ShERF1b regulating sugar accumulation will be identified by analyzing expression patterns of candidate target genes during sucrose accumulation. Then the binding cis-acting element site on which ShERF1b interacts with the promter of the key target gene will be decided by EMSA. Further, this binding cis-acting element site will be mutated by CRISPR in sugarcane. And the expression of the key target gene and the effects on sucrose accumulation will be analyzed in mutated sugarcane plants. It will clarify the function of ShERF1b and the regulatory pathway of ShERF1b on sucrose accumulation in sugarcane culms. Furthermore, it will clear the molecular regulatory mechanisms of ShERF1b on sucrose accumulation in sugarcane. Meanwhile it will build the basis for high-sugar-content sugarcane breeding and quality improvement.

甘蔗是世界和我国重要的糖料作物，甘蔗茎秆中蔗糖积累调控机制一直是研究热点。研究表明AP2/ERF家族转录因子在植物蔗糖积累过程中起重要作用。前期研究发现甘蔗蔗糖积累茎节中多个AP2/ERF转录因子下调表达，只有ShERF1b上调表达，推测其可能是蔗糖积累的正向调控因子，但具体作用机制不清楚。本项目拟采用ChIP、EMSA等技术分离ShERF1b作用的启动子及其下游靶基因；并分析不同糖含量甘蔗品种茎秆蔗糖积累过程中候选靶基因的表达模式，获得ShERF1b调控糖分积累的关键靶基因；再利用EMSA鉴定ShERF1b与关键靶基因启动子结合的顺式作用元件；进一步运用CRISPR技术在甘蔗体内编辑该顺式作用元件序列，解析ShERF1b对关键靶基因的调控方式及对蔗糖积累的影响，揭示ShERF1b调控蔗糖积累的作用途径，进而阐明其调控蔗糖积累的分子机理。研究结果将为甘蔗高糖品种培育及品质改良奠定基础。

AP2/ERF 转录因子参与调节植物中蔗糖积累，前期研究发现甘蔗中AP2/ERF 转录因子ShERF1b参与调控甘蔗中蔗糖积累过程，然而其调控甘蔗蔗糖积累的作用机制不清楚。本研究分离了14个不同甘蔗品种中ShERF1b全长基因，对ShERF1b编码蛋白结构及进化特征进行分析。分离ShERF1b启动子序列pERF1b，构建pERF1b驱动GUS表达载体，获得pERF1b驱动GUS转基因甘蔗植株。亚细胞定位分析结果表明ShERF1b是一种细胞核定位蛋白。构建ShERF1b-Flag融合植物表达载体，利用农杆菌介导法遗传转化甘蔗，成功获得ShERF1b-Flag融合蛋白稳定过表达甘蔗植株。利用Flag抗体进行甘蔗体内免疫共沉淀分离甘蔗糖分积累茎节中ShERF1b结合靶序列，获得ShERF1b结合显著富集Peak序列；对Peaks序列在染色体上的分布位置进行定位，分析获得Peak关联基因。对Peak序列关联基因进行GO、KEGG注释发现ShERF1b调控靶基因主要为信号传导及碳水化合物代谢途径基因，表明ShERF1b调控甘蔗体内信号传导及碳水化合物代谢。从ShERF1b调控靶基因中筛选出19个蔗糖积累调控相关候选靶基因，利用Motif分析获得4个参与蔗糖代谢及糖分积累调控关键基因（蔗糖合成酶SuSy2、蔗糖转化酶INV、DREB1J、ARF22）的Peak序列中ShERF1b结合位点序列，并根据结合位点序列开展ShERF1b与靶序列体外结合凝胶阻滞试验。构建ShERF1b CRISPR/Cas9基因编辑载体，利用农杆菌介导法将Cas9及sgRNA序列转入甘蔗中，对ShERF1b基因编辑位点序列突变情况进行Hi-TOM测序分析发现在PAM序列上游3-5bp处发生1-5bp删除突变，基因编辑效率高于90%，成功获得ShERF1b基因编辑甘蔗。对ShERF1b过表达及基因编辑甘蔗表型进行分析发现ShERF1b过表达可以提高甘蔗生物量积累及产量，证实甘蔗中ShERF1b是调控甘蔗生物量积累及产量形成的关键基因。本研究解析甘蔗中ShERF1b基因功能及其调控蔗糖积累的关键基因，确定ShERF1b对甘蔗生物量积累及产量的促进作用，为高糖高产甘蔗品种培育及甘蔗品质遗传改良提供基因资源及理论支撑。