Slo家族钾通道过度激活致痫的细胞和分子机制的研究

Recently, genetic research has revealed that several types of genetic family Epilepsy patients carry Slo family channel mutations. Our recent work revealed that these mutants lead to channel over-activity by increasing open probabilities （Po） of Slo channels. However, how the Po of Slo channels is altered and how these mutants cause seizures remains elusive. In this project, we will address molecular mechanisms that how these mutants increase channel open probabilities by using the methods of patch-clamp recordings in the Xenopus expression system, crystallography, computer modeling and simulations. In the meantime, we will take advantage of both channel knockout (Loss-of-function) and mutant (Gain-of-function) mice to investigate cellular mechanism of the mutants lead to seizure by combing the methods of brain-slice recordings, immunostaining, ion selective electrode and fluorescence probes. The overall goal of this project is going to provide a theoretical basis for understanding the mechanism of seizures induced by Slo-family mutants. Also, the results of this project can help clinicians select effective methods and drugs for treatment of epilepsy patients who carry these mutants.

近年遗传学研究发现多种家族性遗传癫痫病患者携带Slo家族钾通道基因的突变。我们最近的研究表明这些突变通过提高通道开放可能性 (Po)导致通道过度激活。然而这些突变如何改变通道开放可能性以及怎样诱发癫痫仍未得到阐明。本课题将以此为切入点，运用爪蟾卵母细胞表达系统，采用双电极、内向外膜片钳记录方法，结合结晶学、计算机模拟揭示这些突变产生过度激活的分子机制。同时本项目将采用基因敲除(Loss-of-function)小鼠、过度激活致痫突变(Gain-of-function)小鼠，通过行为学、免疫双标、离子选择性电极、分子荧光探针和电生理膜片钳相结合的方法，以分子-细胞-脑区-行为整合研究阐明突变过度激活导致癫痫的细胞生物学机制。本课题将为深入理解Slo家族钾通道过度激活致痫机制提供理论基础，也为临床医生对携带这些突变的癫痫病人寻求相应的治疗方案和药物选择提供依据。

癫痫是常见的高发神经系统疾病。近年遗传学研究发现越来越多的多种家族性遗传癫痫病患者携带Slo离子通道家族基因的突变。本项目是基于本实验室前期研究发现Slo2.2通道的12个癫痫相关突变通过提高通道开放可能性(Po)导致通道过度激活的结果而申请立题研究并获批。通过四年的研究，本课题首先通过形态学明确了Slo1(BK)和Slo2.2(Slack)通道基因表达的核团；运用分子突变，双电极和内面向外膜片钳技术，揭示了Slo1和Slo2.2癫痫相关突变过度激活共同/不同的生物物理机制。结果表明：BK和Slack通道突变，均更容易被外源性和内源性PIP2激活；BK通道的两个过度激活突变hD434G和hN995S, 均增强了钙离子的敏感性，而在最近发现的11个Slack癫痫突变体中，5个突变增强了对钠离子的敏感性，10个突变通过提高单通道的开放可能性(Po)使通道过度激活。计算机分子动力学模拟（MD simulation）结果表明，这些突变体均通过改变通道蛋白局部构象的柔性使通道处于更容易激活状态。RNAscope数据显示，小鼠大脑中的BK通道主要在抑制性神经元中表达，而Slack通道在兴奋性神经元和抑制性神经元中都有表达。同时，结合基因敲除（KO）小鼠和过度激活突变小鼠，我们揭示了Slo通道突变导致癫痫发作的神经生物学机制。脑片电生理实验表明：Slack通道敲除可降低神经元动作电位阈值，增加产生动作电位的频率。而gain-of-function突变则产生相反的效果。综上所述，本项目结合离体和在体方法，阐释了Slo家族突变导致癫痫的分子和神经生物学机制，并以此深化了离子通道致痫机制的理解，为对携带这些突变的癫痫病人发展新的药物提供新思路。