民族民间药用植物吉祥草中基于线粒体途径诱导CASKI细胞凋亡活性皂苷的成分解析及其抗肿瘤作用机制研究

Reineckia carnea belongs to Reineckia species of Convallariaceae in Liliaceae family, which is abundant in the region of the south of the Yellow rivor in China. As a folk and enthanic medicine, its total plant was specified in local pharmacopoeia of Hubei Province and Yunnan Province, and reputed in Tujia and Miao Nations. Our previous study showed that it contained enriched steroidal saponins in structures and content, potent citotoxicity against CASKI tumor cell line, little toxicity towards normal cells, and selected inhibitory action towards tumor cells. Also, a sapinin abounded in this plant exerted strong inhibitory activity towards CASKI cells with its IC50 as 3.71 micromole. Meanwhile, this saponin markedly inhibited apoptosis of CASKI cells and arrested the cell proliferation to G2/M stage, accompanied with the massive release of cytochrome C. It was reported that chemotherapeutics via mitochondria showed many characteristic advantages, such as age-promoting for tumor cells and anti-resistance for chemotherapeutics. Significantly, this kind of steroidal saponin is possibbly involved in these events above. This program intends to explore the induction mechanism of CASKI cell apoptosis via mitochondria by steroidal saponins, based on systematically isolated and elucidated the steroidal saponins in Reineckia carnea, to obtain leading compounds with antitumor effects via mitochondria from this plant.

吉祥草(Reineckia carnea)为百合科铃兰族吉祥草属草本植物，药用全草，在我国黄河以南地区广泛分布，资源十分丰富，是土家族和苗族等民族的名药，在湖北、云南等省已收载为地方中药材。在我们的前期研究中发现，吉祥草总皂苷含有结构丰富的甾体皂苷，具有良好的CASKI细胞毒活性，对正常细胞毒性很小，对肿瘤细胞具有一定的选择性，其中一个含量较高的螺甾皂苷IC50为3.71微摩，可显著诱导CASKI细胞凋亡，阻滞细胞增殖于G2/M期，伴随细胞色素C大量释放。已有研究表明，线粒体途径的化疗药物在解决肿瘤耐药性方面具有独特优势,且线粒体瓦解与肿瘤细胞衰老直接相关。本课题旨在系统分离纯化吉祥草总皂苷、以其诱导细胞凋亡作用的线粒体途径为立论基础探讨其作用机制，以期发现结构新颖、主要经由线粒体途径作用的抗肿瘤先导化合物。

本项目从吉祥草根茎中分离获得36个化合物，包含16个甾体皂苷。这36个化合物中有11个化合物为新化合物，14个化合物为首次从吉祥草属植物中分离得到。本项目对其重要的活性成分螺甾烷型甾体皂苷RCE-4进行了全合成方面的研究，完成了RCE-4苷元的全合成工作并得到了系列RCE-4类似物，。在活性研究方面我们主要开展了以下工作：① 进行了RCE-4的选择性抗肿瘤活性研究：实验结果表明，甾体皂苷RCE-4对正常细胞如猴肾细胞(marc-145)、犬肾细胞(MDCK)的细胞毒性较小，但是对人宫颈癌细胞(Caski)、鼻咽癌细胞(CNE2)、结直肠癌细胞(HT-29)具有很显著的生长抑制作用，并且呈时间依赖性和剂量依赖性，其中以对Caski细胞的细胞毒性最为显著。② 进行了RCE-4对Caski细胞凋亡实验研究：研究表明RCE-4可显著促进Caski细胞凋亡，并证实抑制PI3K/Akt/NF-κB/炎症因子、Survivin、COX-2基因和线粒体凋亡通路是其发挥抗Caski作用的作用机制之一。③ 进行了RCE-4对Caski细胞自噬实验研究：实验结果表明RCE-4能激活细胞自噬，其诱导的Caski细胞自噬具有抑制自噬的细胞保护性作用，证实该途径可能是其发挥抗肿瘤作用机制之一。④ 进行了RCE-4对裸鼠Caski宫颈癌抗肿瘤实验研究：实验结果表明RCE-4对裸鼠Caski宫颈癌的生长具有显著抑制作用，其作用机制可能与上调Bax、Caspase-9、Caspase-3和下调Bcl-2、COX-2的表达有关。⑤ 进行了RCE-4抗肝癌细胞活性研究：实验结果表明RCE-4对H22和HepG2细胞均有很明显的抑制作用。⑥ 进行了RCE-4对小鼠H22肝癌的实验研究：RCE-4可抑制荷H22腹水瘤小鼠抑制腹水的生成，但在存活时间上没有优势；RCE-4可抑制荷H22实体瘤小鼠瘤体积和瘤重，对小鼠的血液常规指标、血液生化指标和免疫系统和组织形态学均没有显著性的副作用。通过上述研究，获得抗肿瘤活性独特的甾体皂苷先导化合物RCE-4，丰富螺甾皂苷抗肿瘤活性构效关系。同时，通过本研究，可以进一步解析甾体皂苷类化合物抗肿瘤作用的特征、作用靶点、作用途径，提供可用于肿瘤生物学研究的甾体类化合物小分子探针，为沟通肿瘤细胞凋亡、自噬调控网络的某些环节提供了线索，同时也新型抗肿瘤药物的研发提供了理论基础。