吉祥草中螺甾皂苷类化合物的抗肿瘤活性及基于线粒体途径的作用机制研究

The liliaceae plant reineckia carnea is believed to be rich in screw steroidal saponins compositions.In Our previous studies,we have isolated and identified five screw steroidal saponins compositions from n-Butanol part of Reineckia carnea.The compounds have good cytotoxic activity on human renal cancer 786-O cells.one deformated screw steroidal saponin with the IC50 of 15.31uM can significantly induce 786-O cells apoptosis. Adopting modern extraction and separation technology, the project intends to isolate new screw steroidal saponins from reineckia carnea which is abundant in South Jiangxi Province on the basis of preliminary studies. MTT assay will be applied to screen anti-tumor activity of the steroidal saponins on human lung cancer A549 cells, human renal cancer 786-O cells and human colon cancer HT-29 cells.Using portability tumor animal models, the target compounds which have anti-tumor activity in vitro will be tested the activity further in vivo.Using FCM,immunochemical method,Western blot,RT-PCR and other experimental methods,the molecular mechanism of antitumor activity of the target compounds based on mitochondrial pathway will be explored from the molecular level, cellular level and animal level. Through the study of the project, we will optimize drug candidate molecules with novel structure, strong activity and low toxicity.

百合科吉祥草（Reineckia carnea）含有结构丰富的螺甾皂苷，本课题继前期工作从吉祥草正丁醇萃取部位分离并鉴定五个螺甾皂苷化合物，具有良好的786-O细胞毒活性，其中一个变形螺甾皂苷IC50为15.31uM，可显著诱导细胞凋亡。本项目拟在前期研究基础上采用现代提取分离技术从赣南地区资源丰富的吉祥草中定向分离出新型螺甾皂苷类化学成分，采用MTT法以人肺癌A549细胞、人肾癌786-O细胞和人结肠癌HT-29细胞作为体外抗肿瘤实验模型对该类化合物进行抗肿瘤活性筛选，拟选用移植性肿瘤动物模型，对体外具有抗肿瘤活性的目标化合物进行体内抗肿瘤活性测试，基于线粒体途径采用FCM、免疫化学法、Western blot、RT-PCR等实验方法从分子水平、细胞水平、动物水平三个层次探讨该类活性化合物抗肿瘤作用的分子机制。通过本项目的研究，有望优选出结构新颖、活性强、毒性低的抗肿瘤药物候选分子。

百合科植物吉祥草Reineckia carnea (Andr.) kunth含有结构丰富的螺甾皂苷。本课题采用现代提取分离技术从吉祥草中分离螺甾皂苷类化学成分，以体外抗肿瘤细胞模型、采用MTS法对所得化合物进行抗肿瘤活性筛选，基于线粒体途径采用FCM、免疫化学法等探讨该类活性化合物抗肿瘤作用的分子机制。本实验从吉祥草中分离并鉴定了16个化合物，其中2个为新化合物，9个螺甾皂苷类化合物为首次从吉祥草中分离得到。通过 MTS 法对吉祥草中分离得到单体化合物进行了抗肿瘤活性筛选，发现原薯蓣皂苷、重楼皂苷H、纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷对白血病HL-60、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7、结肠癌SW480、肺癌细胞（六种）均具有较好的增殖抑制活性，其中对各类肺癌细胞株作用较强。本课题以抗肿瘤活性强的纤细薯蓣皂苷（Gracillin）为研究对象，以肺癌A-549细胞为体外抗肿瘤模型探讨其抗肿瘤作用机制。采用MTS法考察Gracillin对A-549细胞的体外抗肿瘤活性，发现Gracillin对A-549细胞的增殖抑制率呈现剂量依赖关系和时间依赖关系，作用24h时IC50值为2.97μM；通过Hoechst 33258凋亡染色发现经Gracillin处理的细胞有明显的形态学变化，出现典型的凋亡形态，显示Gracillin具有促凋亡作用；应用流式细胞术Annexin Ⅴ-FITC/ PI双标记法定量实验可见随着药物Gracillin的浓度增大，细胞凋亡率逐渐增加；细胞周期分析中显示药物作用后G1期细胞减少，S期细胞增多；采用FLUO-8AM、JC-10染色标记后于流式细胞仪测定细胞内钙离子浓度和细胞线粒体膜电位，发现细胞内钙离子浓度增加、细胞的线粒体膜电位降低，实验初步阐明Gracillin诱导A549细胞凋亡的机制与线粒体途径中的细胞内钙超载、线粒体膜电位下降等有关。本课题研究可为Gracillin用于临床抗肿瘤治疗提供方向，同时为吉祥草的开发应用提供理论依据。