甘蓝显性蜡质缺失基因BoGL的克隆与功能验证

As one of the important quality characters, color of cabbage leaves is usually greyish green or dark green. But different from the common ones, the leaf color of cgl-2, a waxless mutant material from normal ones, turns to be glossy green. In addition, strong heterosis and glossy green appearance are exhibited in the F1 plants. All the above characteristics of cgl-2 show that it has great potential for the cabbage breeding of the glossy green character.. The glossy waxless gene BoGL (Brassica oleracea Glossy Leaf) will be cloned with the modified MutMap method and the function of BoGL will be analyzed by genetic transformation and CRISPR/CAS9 system. The gene regulatory networks will be studied through the RNA-seq.The implement of this project will provide great help for the study of the molecular mechanism of the waxless character in the glossy materials and the application of glossy waxless character in cabbage transgenic breeding. Furthermore, new research methods about the cabbage functional genes will be obtained through this project.

球叶颜色是甘蓝的重要品质性状，普通甘蓝球叶表面有一层蜡质，一般表现为灰绿色或深绿色。甘蓝显性蜡质缺失突变体cgl-2是由普通有蜡粉甘蓝突变而来，具有球色亮绿、有光泽、商品品质好的特点。以cgl-2配制的杂交组合亦表现球色亮绿且具有明显的杂种优势，在甘蓝育种中具有很好的实际应用价值。. 本项目以单基因显性蜡质缺失突变体cgl-2及其近等基因系为材料，应用MutMap快速克隆蜡质缺失基因BoGL（Brassica oleracea Glossy Leaf）；应用遗传转化和CRISPR/CAS9基因编辑技术对BoGL基因进行功能验证；通过转录组数据分析，探索目的基因及其下游基因的调控网络。本项目的实施将对明确蜡质缺失的分子机制、探索CRISPR/CAS9基因敲除技术在甘蓝类作物上的应用具有重要意义，为应用基因工程技术创制亮绿甘蓝新种质并用于品质育种奠定基础。

甘蓝蜡质缺失突变体具有叶色亮绿美观等特点，在甘蓝品质育种中具有重要的应用价值，同时也是研究植物蜡质代谢调控的重要资源。本项目以甘蓝显性蜡质缺失突变体cgl-2及其野生型为研究材料，将显性蜡质缺失基因BoGL精细定位于8号染色体末端33.5-kb的区间内，将定位区间内与拟南芥CER1同源的基因Bo8g118320确定为候选基因（命名为BoCER1）；除根系外，BoCER1基因在甘蓝的各个组织中均有表达；BoCER1蛋白亚细胞定位于内质网中；通过重测序分析发现BoCER1基因在突变体中存在异常/缺失；为验证BoCER1基因的功能，构建了CRISPR/CAS9基因敲除载体，在甘蓝中建立了成熟的CRISPR/CAS9基因编辑体系，完成了野生型BoCER1基因的敲除，基因敲除植株表现出蜡质缺失表型。由此确定，BoCER1基因突变是造成cgl-2蜡质缺失的主要原因。结合转录组数据，进一步分析了甘蓝蜡质代谢通路中相关基因的表达特征，探索了BoCER1及其上下游基因的调控网络。另外，对项目组发现的其他蜡质缺失突变体进行了遗传分析及蜡质缺失基因的克隆。本项目研究对于揭示甘蓝蜡质缺失性状形成的分子机制具有重要意义，也为后续应用基因工程技术创制亮绿甘蓝新种质奠定了重要基础。