十大功劳叶中羽扇豆烷型三萜对TLR4/NF-kB通路的调节机制研究

The pro-inflammatory NF-κB pathway is central to the regulation of inflammation. NF-κB is found to be chronically active in many inflammatory diseases. Therefore, it is an important way for discovery the anti-inflammatory drug from natural products based on NF-kB target isolation. Up to now, our team has isolated nine lupane triterpenes (LPTS) from of Mahonia bealei leaves based on active tracking separation, among which eight LPTs were first isolated from Mahonia. LPTS revealed significant anti-inflammatory effect as well as NF-kB inhibitory effect. To date, the detail molecular mechanisms of immune regulation and the site of action for LPTs are still vague. On the basis of our preliminary work, a multi-disciplinary systematic study including phytochemistry and molecular biology techniques is proposed. NF-kB luciferase report gene is used as a model for screening of activity. Based on the rapid analysis of ultra-performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection/ mass spectrometry (UPLC-ELSD/MS), a variety of chromatographic technology and pectroscopic approaches will be proposed and LPTs will be rapidly screened, isolated and elucidated. Meanwhile, mechanism involved in anti-inflammatory activities will be carried out. In this project, our findings will establish solid scientific foundation for illustration of the anti-inflammatory effect of LPTs, and also provide theoretical basis for reasonable development of this plant resource.

NF-kB作为炎症信号的最终汇合点，可参与多种炎症介质的表达调控。因此通过靶向分离技术从天然产物中发现以NF-kB为靶点的化合物是寻找抗炎药物的重要途径。前期对十大功劳叶活性跟踪分离得到9个羽扇豆烷型三萜类化合物 (LPTs)，其中有8个LPTs是首次从十大功劳属植物中得到。进一步研究发现LPTs具有显著的抗炎作用，并可抑制NF-kB的活性，而LPTs潜在作用靶点筛选及相关信号通路的研究报道较少。本项目拟在已有研究基础上，利用NF-kB为靶标的荧光素酶报告基因分析方法进行活性筛选，应用UPLC-ELSD/MS对十大功劳叶中LPTs成分进行快速识别分析，指导化合物的分离与鉴定；采用分子生物学方法，研究其抗炎分子机制，并阐明其作用受体以及相关信号通路。本项目将挖掘十大功劳叶中具有抗炎活性且结构新颖的LPTs并揭示其分子作用机制，同时为合理开发我国十大功劳属植物资源提供理论依据。

炎症相关疾病的发病率日益增长，严重困扰着人们的生命健康，但现有的非甾体类抗炎药物（NSAIDs）和甾体类抗炎药物（SAIDs）的使用能引起胃黏膜和心血管损伤、肾上腺皮质功能亢进等不良反应，其安全性问题不容忽视，所以研究人员将目光投向了具有抗炎作用的天然产物，天然产物结构和生物活性的多样性使药物设计具备独特的化学结构和药理活性。前期从十大功劳叶的二氯甲烷萃取段分离出一系列羽扇豆烷型三萜，其中20-Hydroxy-3-oxolupan-28-oic acid（HOA）活性最佳，以脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7巨噬细胞为炎症模型探讨HOA的抗炎活性及其作用机制。（1）通过检测细胞活性以及一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的释放量发现：50 μM以下为HOA的安全使用范围，HOA能够抑制巨噬细胞活化后炎症介质NO、TNF-α和IL-6的释放，在倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察发现，HOA有效改善了LPS刺激引起的RAW 264.7细胞的活化状态。（2）转录组测序分析结果表明，LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞后，C/LPS组差异表达基因在炎症过程，免疫过程和细胞对干扰素β的应答过程显著富集。HOA预处理细胞后，LPS/HOA组差异表达基因显著富集在趋化过程、对层流剪应力的响应过程和GTP酶活性的正调控过程，并且KEGG结果显示差异基因在炎症反应相关的NF-B信号通路，细胞因子-细胞因子相互作用，Rap1信号通路，趋化因子信号通路和Jak-STAT通路上显著富集。与炎症反应相关的15个差异基因的RT-qPCR验证结果与转录组测序的基因表达结果趋势一致。（3）通过半定量和实时定量PCR检测发现，HOA能够呈剂量依赖性的抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-6和TNF-α mRNA的表达，另外，通过免疫荧光法和蛋白印迹法分析发现，HOA能够抑制上游信号分子p85、PDK1、Akt、IBα、ERK和JNK的磷酸化以及核因子κB（NF-κB）/p65的核转位。综上所述HOA可以作为一种潜在的抗炎药物应用于医疗领域。