泽泻原萜烷型三萜类化合物生物合成关键酶及其功能研究

原萜烷型四环三萜类化合物是泽泻属等少数植物类群中所特有的活性成分，具有抗癌、抗高血脂、抗HIV等生理活性，应用前景广阔。然而，由于该类资源性成分自然分布窄，含量低，不能满足利用需求，生物工程是提高该类化合物合成效率的重要途径。本项目在前期工作基础上提出：泽泻原萜烷型三萜类成分在甲羟戊酸途径合成氧化鲨烯的基础上，进一步通过环化和官能化而形成，其合成效率与三萜类化合物生物合成共有关键酶和催化原萜烷型三萜骨架形成的专属关键酶等表达水平密切相关。拟开展研究工作如下：(1)泽泻原萜烷型三萜类化合物生物合成关键酶基因分子克隆及序列分析；(2)关键酶基因重组表达及蛋白功能鉴定；(3)关键酶基因在泽泻植物体内的表达；(4)关键酶基因表达水平与泽泻原萜烷型三萜类化合物含量之间的相关性分析。以确定泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径中关键酶及其功能，为该类资源性成分生物合成途径的阐明和生物工程应用提供科学依据。

原萜烷型四环三萜类化合物是泽泻属等少数植物类群中所特有的活性成分，该类成分具有明显的抗高血脂、降血压、抗癌等活性，自然分布窄，含量低。本课题运用同源克隆和快速 cDNA 末端扩增技术克隆泽泻原萜烷型三萜类化合物生物合成关键酶羟甲基戊二酰CoA还原酶(AoHMGR)、法呢基焦磷酸合酶(AoFPPS)、鲨烯合酶(AoSS)、鲨烯环氧化酶(AoSE)、氧鲨烯环化酶(AoOSC)等基因全长并进行生物信息学分析，获得的关键酶基因AoHMGR、AoFPPS、AoSS、AoSE1、AoSE2、 AoOSC1和AoOSC2全长序列；在此基础上成功构建原核表达载体，诱导关键酶基因外源表达；利用体外酶促反应验证其功能，气相色谱-质谱联用分析结果表明，获得的7个关键酶均具有相对应的催化功能；进一步用获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体，所获得的抗体效价高，均可较好地特异性识别目标蛋白，亦表明成功建立了快速免疫检测方法，这为在蛋白水平上关键酶基因调控机制研究提供了必要条件；不同的关键酶基因表达具有组织特异性，在活性成分积累高峰期块茎中的表达量均比其他器官高；采用 QRT-PCR和Western blotting在转录和翻译水平上比较泽泻关键酶基因基因在不同生长期的表达规律，运用 HPLC 测定不同生长时期活性成分 23-乙酰泽泻醇 B 的含量，并分析二者之间的相关性，关键酶基因表达量与活性成分含量呈显著正相关，进一步证明AoHMGR、AoFPPS、AoSS、AoSE1、AoSE2、 AoOSC1和AoOSC2是泽泻原萜烷三萜类化合物生物合成途径中的重要调控位点。研究结果为后续原萜烷三萜类化合物生物合成的调控研究提供基础，也为该类资源性成分生物合成途径的阐明和生物工程应用提供科学依据。