脑缺血时miRNA对细胞凋亡基因调控及西洋参茎叶皂苷抗凋亡作用靶点的研究

应用miRNA表达谱液相芯片检测大鼠局灶性脑缺血后不同时间点脑组织miRNA差异表达状况,并以荧光定量PCR进行验证，分析脑缺血时miRNA表达的时间变化，筛选出与数据库所预测的对细胞凋亡基因bcl-2、caspase-3 调控相一致的miRNA；利用过表达技术与靶向封闭技术，在大鼠脑皮质神经细胞拟缺血损伤模型上观察所筛选出的miRNA对bcl-2、caspase-3表达的调控作用，确认出调控这些基因的特定miRNA，并观察PQS对特定miRNA的影响；应用双萤光素酶报告基因技术进一步确定特定miRNA对bcl-2、caspase-3的作用位点，将首次从miRNA水平阐明脑缺血细胞凋亡的某些调控机制及PQS抗脑缺血细胞凋亡作用的miRNA靶点，为miRNA靶基因发现及功能研究提供新实验数据，为进一步研究缺血性脑血管病发病的分子机制、发现新型的药物作用靶点提供新的研究思路和实验基础。

目的和方法：通过miRNA表达谱芯片分析大鼠局灶性脑缺血24h后脑组织miRNA的表达变化；利用过表达技术和靶向封闭技术在拟缺血损伤神经细胞模型上确认调控细胞凋亡基因bcl-2、caspase-3的miRNA；利用双荧光素酶报告基因技术和突变方法确定这些miRNA调控bcl-2、caspase-3的靶位点；同时阐明西洋参茎叶皂苷（PQS）抗凋亡作用的相关机制。. 结果：基因芯片检测结果显示大鼠局灶性脑缺血24h后，缺血皮质区脑组织有36个miRNAs 差异表达显著。生物信息学分析差异明显的miRNA提示miR-129和miR-384-5p所对应的靶基因可能为bcl-2和caspase-3。利用miR-384-5p模拟物过表达miR-384-5p或miR-129抑制物低表达miR-129均明显增加细胞活力、降低LDH释放、减少细胞凋亡；反之则促进细胞凋亡和损伤。此外，过表达或低表达miR-129分别明显抑制或增加抗凋亡蛋白bcl-2 mRNA和蛋白的表达；过表达或低表达miR-384-5p分别明显降低或增加促凋亡蛋白caspase-3蛋白表达，而过表达和低表达miR-384-5p均没有明显影响caspase-3 mRNA的表达。双荧光素酶报告活性分析结果显示caspase-3是miR-384-5p的直接靶基因，而bcl-2不是miR-129的直接靶基因，miR-129可能通过其他相关机制来调节bcl-2的表达。PQS可明显增高miR-384-5p mRNA表达水平、降低miR-129 mRNA表达水平，进而调节bcl-2、caspase-3的表达，起到抗细胞凋亡作用。. 结论：局灶性脑缺血诱发大鼠脑组织多种miRNAs 差异表达显著，其中miR-384-5p、miR-129可通过对其直接或间接靶基因caspase-3、Bcl-2的调节来调控神经细胞凋亡，从而参与脑缺血损伤的发病机制，并成为缺血性脑损伤治疗的潜在靶点。此外，PQS具有明显的抗细胞凋亡作用，而miR-384-5p和miR-129可能成为PQS抗脑缺血细胞凋亡作用的靶点。本研究为miRNA 靶基因发现及功能研究提供新实验数据，为进一步探讨缺血性脑血管病发病的分子机制、发现新型的药物作用靶点提供新的研究思路和实验基础。