卵巢癌肿瘤内异质性的遗传生物学特征分析及相关分子靶标的筛选

Our research will focus on the genetic and biological characteristices analysis and potential molecular biomarkers screening of intratumor heterogeneity in epithelial ovarian cancer.SP cells and CD117+ cells will be obtained by flow cytometry;subclonal cancer cells will be obtained by single cell culture via limited dilution method. Three pairs of cell lines will be cultured in vitro and used to establish animal model, to compare their differences in morphology,proliferation,differentiation, drug resistance,and tumor formation in vivo.Whole genome sequencing and comparative genomic hybridization will be used to analyze gene mutations, gene copy number variations, and chromosome aberration. Protein chip, methylation chip,and miRNA chip will be adopted to screen the potential molecular biomarkers invovled in intratumor heterogeneity. Finally, tissue microarrys and cancer cell lines primarily cultured from ovarian cancer patients will be used to verify the functions of screened molecular biomarkers invovled in metastasis and recurrence of ovarian cancer.

本研究将进行卵巢癌肿瘤内异质性的遗传生物学特点分析及相关分子靶标的筛选。流式分选获得遗传背景相同的卵巢癌细胞系中存在的侧群细胞、CD117+细胞;有限稀释法对卵巢癌细胞进行单细胞培养，分离获得异质性亚群。对分选获得的3种异质性细胞体外培养扩增，建立相关的动物模型。比较它们在细胞形态、分化能力、细胞周期、增殖能力、抗药性及裸鼠异体移植成瘤能力等方面的差异；利用外显子和/或全基因组测序，比较基因组杂交研究基因序列和基因拷贝数目的变化，并进行染色体畸变分析；通过蛋白芯片，甲基化芯片，miRNA芯片研究与卵巢癌肿瘤内异质性相关的分子及调控机制。最后应用卵巢癌原发/转移/复发病灶的组织芯片以及来自同一患者的原发肿瘤细胞系和复发肿瘤细胞系，验证筛选出的分子标记物是否在卵巢癌转移，复发和耐药过程中产生差异性，并明确其临床意义，为提高卵巢癌的诊治水平提供新的诊治思路。

本研究进行卵巢癌肿瘤内异质性的遗传生物学特点分析及相关分子靶标的筛选。比较它们在细胞形态、分化能力、细胞周期、增殖能力、抗药性及裸鼠异体移植成瘤能力等方面的差异；利用外显子和/或全基因组测序，比较基因组杂交研究基因序列和基因拷贝数目的变化，并进行染色体畸变分析；通过蛋白芯片，甲基化芯片， miRNA芯片研究与卵巢癌肿瘤内异质性相关的分子及调控机制。最后应用卵巢癌原发/转移/复发病灶的组织芯片以及来自同一患者的原发肿瘤细胞系和复发肿瘤细胞系，验证筛选出的分子标记物是否在卵巢癌转移，复发和耐药过程中产生差异性，并明确其临床意义，为提高卵巢癌的诊治水平提供新的诊治思路。通过本课题的研究，我们发现：1、A-H 和 A-L，S-H 和 S-L，不但在体外侵袭、迁移能力方面，在细胞增殖、生长周期、抗凋亡及失巢凋亡、自噬活性、抗药性，以及裸鼠异体移植成瘤能力等多个转移相关的表型特征方面，均具有显著的异质性，高侵袭单细胞亚群表现出更强的独立存活能力。2、A-H 和 A-L，S-H 和 S-L，在染色体水平上也具有明显的异质性，而4个单细胞亚群内部则表现出良好的均质性。Exome Seq 数据在 A-H 和 A-L 文库中，发现 612 个表达差异的基因；在 S-H 和 S-L 文库中，发现 594 个表达差异的基因，经逐步筛选和过滤，最终在2组高、低侵袭亚群之间获得共同差异基因变异位点共计66个。选择部分候选基因经 Real Time PCR 验证，发现PI3K/AKT/mTOR 信号 传导通路中，PIK3CA、PIK3CA、AKT3、ECM1、GPCR 等基因的 mRNA 在 A-HS-H 中均显著增高,肿瘤抑制基因 Nur77，PTEN 显著降低。MTOR通路中，mTOR PRKCB 基因的 mRNA 在 A-H、S-H 中亦显著增高。3. 卵巢癌在复发过程中存在肿瘤异质性，主要表现为PcG蛋白的表达异质性以及相应的遗传学和表观遗传学的改变。4. 巨噬细胞对卵巢癌细胞系exosome的内吞作用；exosome促进巨噬细胞向M2型极化；经过卵巢癌exosome诱导的巨噬细胞能够增加卵巢癌细胞的增殖能力，能够增加卵巢癌细胞的迁移、浸润能力、卵巢癌细胞的耐药性。