RBP-4对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响及其机理研究

Retinol-Binding Protein 4 (RBP-4) is a low molecular weight lipocalin, which mainly functions as a carrier for vitamin A. Recent evidences have shown that RBP-4 plays important roles in animal reproduction, for example, increasing the development of uterus and embryo. Our laboratory firstly reported that high level of RBP-4 existed in follicular fluid from follicular cysts in sows. RBP-4 could be secreted by granulosa cells, and RBP-4 receptor was detected in granulosa cells. However, there is no any evidence on the regulation of RBP-4 in follicular granulosa cells. Techniques of gene chip, siRNA, cell transfection, etc. will be used to study the regulating roles of RBP-4 on proliferation of granulosa cells; and to study the genes and signal transduction in granulose cells regulated by RBP-4 from different aspects. The project will provide new theoretical evidences for the role of RBP-4 in the development of ovarian follicle, and further provide potentially therapeutic targets for follicular cysts of sows.

视黄醇结合蛋白-4（RBP-4）是一种低分子量的载脂蛋白，其主要作用是结合和转运维生素 A。近年来国内外文献报道了RBP-4在繁殖过程中某些方面的作用，如促进子宫生长和胚胎发育。本课题组曾在国际上首次报道了猪囊肿卵泡液中含有高浓度的RBP-4，还发现猪卵泡颗粒细胞上表达RBP-4及其受体，体外培养的猪颗粒细胞可以分泌产生RBP-4。然而，RBP-4对卵泡发育的作用尚不清楚，对卵泡颗粒细胞的调节尚无报道。因此，本项目通过基因芯片、siRNA、细胞转染等技术，研究RBP-4在猪卵泡颗粒细胞增殖中的作用、下游基因、信号转导机制，为阐明RBP-4在母猪卵泡发育中的作用提供理论依据，期望为母猪卵泡囊肿的治疗提供新的靶点。

视黄醇结合蛋白-4（RBP-4）是一种低分子量的载脂蛋白，其主要作用是结合和转运维生素A。近年来国内外文献报道了RBP-4在繁殖过程中某些方面的作用，如促进子宫生长和胚胎发育。.为探明RBP-4在猪卵泡发育中的调节作用，本项目根据前期研究基础，以猪卵泡颗粒细胞为研究对象，利用不同实验手段，从不同角度，研究了RBP-4对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响。.（1）研究了RBP-4在猪卵巢组织中的分布及在不同大小卵泡中的表达模式。免疫组化和PCR方法证实了猪卵泡颗粒细胞和内膜细胞表达RBP-4，而卵母细胞不表达。而且qRT-PCR和western blotting检测均证明，大卵泡RBP-4表达量显著高于中、小卵泡。.（2）研究了RBP-4与促性腺激素（FSH、LH）在猪卵泡颗粒细胞中的相互作用。qRT-PCR和western blotting检测发现，FSH、LH能促进猪卵泡颗粒细胞中RBP-4的表达，同时，RBP-4能够促进FSHR、LHR的表达。说明RBP-4与促性腺激素具有相互作用，二者协同促进颗粒细胞生长。.（3）研究了猪卵泡颗粒细胞过表达RBP-4后，对下游microRNA的调节。microRNA高通量测序筛选出81个差异miRNA，预测出7562个靶基因，其中数据库中已有记载的猪源差异miRNA为8个。其中上调3个：miR-142-3p_R2-22L22 、miR-18b_R1-16L23、 miR-32_R1-21L21，下调5个：miR-148a-5p_R1-21L22、miR-193a-3p、miR-378b-3p_R1-18L21、 miR-7857-3p_R1-22L22、ssc-miR-9788-3p_R1-15L22。挑选6个差异miRNA进行了验证，同时进一步研究了miRNA-193a-3p对颗粒细胞增殖的影响机制。.（4）研究了猪卵泡颗粒细胞过表达RBP-4后，对下游基因的调节。转录组高通量测序筛选出113个差异mRNA，71个基因上调，42个基因下调，这些基因参与多种细胞功能，进一步验证了ITGA5、MMP1和IGFBP5三个基因，并且重点研究了IGFBP5对细胞增殖影响的机制。.（5）利用原核表达系统体外表达了猪RBP-4蛋白，制作了RBP-4多抗，同时研究了RBP-4对猪卵母细胞体外成熟的研究。成功构建了猪RBP-4蛋白原核表达载体，成功表达