ATRA对猪卵泡颗粒细胞增殖与分化的影响及调控机制

The proliferation and differentiation of follicular granulosa cells can be regarded as one marker of follicular development. Previous studies have shown that all-trans retinoic acid (ATRA), which is an active metabolite of vitamin A, can participate in the regulation of follicular development and ovulation in the mammal. But its regulatory mechanisms still remain unknown. In this study, we intend to detect the role of ATRA/13cRA in granulosa cell viability, cell cycle and the expression of differentiation marker to determine the effect of ATRA/13cRA on porcine follicle granulosa cell proliferation and differentiation by in situ hybridization, immunohistochemistry, molecular cloning, gene overexpression, RNA interference, flow cytometry, Real-time PCR and Western blot. At the same time, in order to reveal its regulatory mechanisms, we will investigate the effects of the ATRA-related signaling molecules and FoxA family molecules on ATRA regulation porcine follicular granulosa cell proliferation and differentiation. By this study，we will clarify the biological effects and regulatory mechanisms of ATRA. At the same time, it also will be help for the exploitation of new feed additives to improve livestock reproduction and production performance and promote the development of animal husbandry.

卵泡颗粒细胞的增殖与分化可作为卵泡发育的标志之一。相关研究表明，维生素A的活性代谢产物全反式视黄酸(ATRA)可参与调控哺乳动物卵泡发育及排卵过程，但其调控机制尚不清楚。本项目拟采用原位杂交、免疫组化、分子克隆、基因过表达、RNA干扰、流式细胞术、荧光定量PCR及蛋白印迹等技术，通过检测猪卵泡颗粒细胞细胞活性、细胞周期及颗粒细胞分化标志分子表达的变化，探讨ATRA/13cRA在猪卵泡颗粒细胞增殖与分化过程中的作用；通过研究ATRA相关信号分子及FoxA家族分子在ATRA/13cRA调控卵泡颗粒细胞增殖与分化过程中的效应，探讨ATRA对猪卵泡颗粒细胞增殖与分化的调控机制。通过本项目的研究，理论上有助于明确ATRA的生物学作用及其调控机制，实践上对于开发新的饲料添加剂提高家畜繁殖与生产性能，促进我国养殖业的发展具有重要的现实意义。

卵泡颗粒细胞的增殖与分化可作为卵泡发育的标志之一。相关研究表明，维生素A的活性代谢产物视黄酸(Retinoic acid, RA)可参与调控哺乳动物卵泡发育及排卵过程，但其调控机制尚不清楚。本项目采用原位杂交、MTS、EdU、基因过表达、RNA干扰、流式细胞术、荧光定量PCR及蛋白免疫印迹等技术，通过检测猪卵泡颗粒细胞细胞活力、细胞周期及颗粒细胞分化标志分子表达的变化，探讨13cRA与ATRA在猪卵泡颗粒细胞增殖与分化过程中的作用；通过研究RA相关信号分子及叉头盒 A (Forkhead box A, FoxA)家族分子FoxA1在13cRA调控猪卵泡颗粒细胞分化过程中的效应，探讨13cRA对猪卵泡颗粒细胞分化的调控机制；通过细胞全基因组测序，初步筛选出ATRA促进猪卵泡颗粒细胞分化可能的下游靶基因及信号通路。实验结果表明，13cRA和ATRA均可通过促进细胞从G1期向S期的转化从而促进颗粒细胞增殖，13cRA和ATRA处理可显著促进猪卵泡颗粒细胞分化标志基因LHR及PGR的表达。细胞全基因组测序结果表明， ATRA促进猪卵泡颗粒细胞分化可能通过174个下游靶基因及10个信号通路参与而发挥作用。利用基因过表达、RNA干扰、添加抑制剂和激动剂及qRT-PCR等方法研究发现，与RA转运相关基因CRABP2可增强13cRA促进猪卵泡颗粒细胞分化，与RA代谢相关基因CRABP1、CYP26A1及CYP26B1可减弱13cRA促进猪卵泡颗粒细胞分化，RA受体RARβ/RXRβ受体异二聚体介导13cRA调控猪卵泡颗粒细胞分化。应用MTS和qRT-PCR方法检测猪卵泡颗粒细胞FoxA1干扰表达模型中细胞增殖与分化的影响。结果表明，FoxA1可显著抑制颗粒细胞的增殖与分化，同时13cRA处理卵泡颗粒细胞24 h可显著抑制FoxA1基因的表达，其中RA相关信号分子介导了13cRA的作用。同时，干扰FoxA1可显著增强13cRA促进猪卵泡颗粒细胞分化作用。综上所述，13cRA可通过RA相关信号分子抑制FoxA1的表达进而促进猪卵泡颗粒细胞分化。同时，ATRA也可促进猪卵泡颗粒细胞增殖与分化，但其具体调控机制有待进一步验证。本研究的开展将有利于新的饲料添加剂的研发，为提高母猪繁殖性能，促进我国生猪养殖业的发展提供理论支撑。