器官特异性沉默GCDH诱导戊二酸蓄积致纹状体神经元线粒体功能障碍的机制研究

戊二酸尿症Ⅰ型是GCDH基因突变、缺失等引起的单基因遗传代谢性疾病，严重危害婴幼儿脑发育，导致严重的智力和功能障碍，给家庭和社会带来沉重的心理和经济负担。该病患儿多在出生后6～18月在非特异性疾病情况下诱发急性脑病危象，致急性纹状体和皮质损伤，但该病神经毒理损伤的启动和后续机制仍未阐明。如何构建模拟人体发病机制的细胞和动物模型进而探明戊二酸尿症Ⅰ型致脑损伤的分子机制成为当前的研究重点和挑战。本课题结合前期研究基础，拟应用嵌合有鼠脑和肝脏组织特异性启动子的GCDH-shRNA慢病毒载体以器官特异性分靶点沉默组织GCDH酶，筛选出模拟人体发病机制的细胞和动物模型；继而以丝裂原活化蛋白激酶/激活蛋白-1通路为切入点，解析激活蛋白-1下游靶基因与线粒体凋亡通路的关系，从而探索戊二酸尿症Ⅰ型致神经病理损害的机制，寻找参与神经损害过程的关键因子，为其干预治疗及此类遗传代谢性疾病的机制研究提供新思路。

戊二酸尿症Ⅰ型(GA1)是由戊二酰辅酶A脱氢酶（GCDH）活性缺陷导致大量戊二酸蓄积，从而引起急性纹状体和皮质损伤的单基因遗传代谢性疾病，该病神经损伤机制尚未阐明。目前GA1没有理想的实验模型，因此亟需构建一种可以有效模拟该病发病机制的细胞和动物模型进而探索GA1致脑损伤的分子机制。本研究制备出针对不同靶点的3对DNA序列的Ccdh -shRNA慢病毒载体，筛选出沉默效率最高的特异性Ccdh -shRNA慢病毒载体，并且验证了该载体对纹状体神经元、肝细胞系GCDH基因的靶向沉默效率；同时探讨了过量赖氨酸孵育对GCDH基因沉默神经元细胞活性影响及线粒体膜电位变化，探索GA1致神经病理损害的可能机制；以及寻找参与神经损害过程的关键因子如凋亡通路中caspase 3，8，9的表达；另外，在活体动物水平也研究了GCDH-shRNA慢病毒载体靶向沉默大鼠脑纹状体GCDH蛋白的水平。研究结果表明特异性Ccdh -shRNA慢病毒载体能有效且稳定的抑制纹状体神经元和肝细胞系GCDH基因表达，5 mmol/L赖氨酸作用于GCDH基因沉默神经元可模拟GA1患儿高代谢状态，并且成功筛选出能模拟人体发病机制的新型GA1细胞模型，为研究GA1神经损伤机制提供实验基础；同时得出线粒体膜电位变化参与赖氨酸对GCDH基因沉默纹状体神经元神经毒性作用机制，而该神经毒性是caspase途径依赖型；以及Ccdh -shRNA慢病毒载体活体注射后不同时间内均检测到GCDH蛋白的表达变化，为进一步研究戊二酸尿症I型的发病机制与干预治疗奠定模型基础，也为此类遗传代谢性疾病的机制研究提供新思路。