基于转录组测序筛选二乔牡丹复色花形成的关键基因

“Er Qiao” is an rarely bicolour variety of tree peony, of which the distribution of red and white color is not stable in flower. The bicolour of “Er Qiao” represent a novel model of flower color regulation. Up to now, the molecular mechanism of bicolour formation in flower of “Er Qiao” is ambiguous. In this study, we will sequence the transcriptome of petals with red and white color, respectively, by High throughput sequencing technology, followed by comparative analyzed the transcriptome data and clarify the transcript levels of anthocyanin-related genes. Combined with variation analysis of flower pigment composition, we predicted the candidate key gene(s) accounting for bicolour formation. The candidate key gene(s) and its promoter would be cloned , gene function and transcriptional activity of promoter would be verified by transgenic method, which would finally confirmed the function of candidate key gene(s) in the progress of bicolour formation.

二乔牡丹是珍贵稀有的复色品种，同一朵花上红、白两种颜色分布具有不稳定性，代表了一种新颖的花色调控模式。目前，二乔牡丹复色花形成的分子机制尚不清楚。本研究拟以二乔牡丹为研究对象，采用高通量测序技术对两种颜色的花瓣分别进行转录组测序，开展转录组变化的分析，并验证花青素合成相关的基因转录水平的变化。结合花色素成分的差异分析，预测复色形成过程中的关键因。克隆关键基因及其启动子序列，并利用转基因技术验证基因的功能及启动子的转录活性，最终确认所克隆的基因在复色花形成过程 中的作用。本项目的开展将从基因水平阐明一种新的花色调控模式，为培育复色新品种花卉提供新的思路。

复色是花是指花朵有两种及两种以上的颜色，它是花卉的一种重要经济特征，在市场上广受消费者喜爱。二乔是牡丹中一种珍贵的复色品种，同一个植株上可开红、粉两种颜色的花朵，偶尔也有一朵花开两种颜色，广受人们喜爱。本项目主要通过转录组比对分析筛选与二乔牡丹复色花形成相关的基因。通过对红色和粉色花转录组测序，共产生约60 Gb高质量数据，组装了75,699个基因，其中显著差异表达的基因477个。然而在差异表达基因中并未发现与花青素合成相关的基因。以组装结果建立本地数据库，利用注释和BLAST对所有花青素相关基因进行鉴定，并通过定量实时PCR验证其转录水平。结果表明，这种变异并不发生在基因转录水平。在组装结果中对所有花青素合成相关的基因进行鉴定，包括花青素合成、转运和调控基因，并利用qPCR技术对基因在两种类型样本中的转录水平变化进行检测，结果与转录组测序结果完全一致。因此，我们判断二乔牡丹复色的形成不是由于基因转录水平变化引起的。我们将花青素相关的基因从6个测序样本数据库中抽取出来，开展进一步的序列分析，以判断序列多态性与颜色之间的关系。我们在类黄酮-3'-羟基化酶基因中发现了一个GCGGCG小片段插入，位置在编码区第247个碱基的位置，这个插入序列是该基因编码区第241-245个碱基的重复。为了验证此插入序列与花色的相关性，设计一对引物从8株二乔植株cDNA中扩增包含插入序列的片段。结果显示GCGGCG插入序列只出现在粉色花中，而红色花中未检测到此插入片段。系统发育分析表明牡丹类黄酮-3'-羟基化酶基因可以与拟南芥及矮牵牛的该基因聚在一枝。序列比对分析显示只有二乔牡丹粉色花黄酮-3'-羟基化酶基因具有该插入序列。酶活实验表明GCGGCG插入序列降低了类黄酮-3'-羟基化酶催化二氢槲皮素的能力。结合代谢产物分析，我们认为插入序列弱化了类黄酮-3'-羟基化酶的功能，导致花青素含量降低，最终导致二乔牡丹中粉色花的形成。