基于比对转录组测序的苦荞籽粒高黄酮形成关键基因的筛选及功能验证

Buckwheat has becomed more and more attention and love by people due to its rich flavonoids with high health care value. The important area in buckwheat breeding is to improve the flavonoid content of grain. Generally, the flavonoid content of Tartary buckwheat grain is dozens of times higher than that in common buckwheat grain. However, the molecular mechanism that why Tartary buckwheat grain has higher flavonoid content than common buckwheat grain is unclear. In this study, common buckwheat “Chitian1” and Tartary buckwheat “Jinku2” will be selecte as experiment experimental materials. The accumulation patterns of the flavonoid in the different development stages of these two materials grain will be analyzed using HPLC. Comparing the transcriptome sequencing will be performed in the different development stages of these two materials grain to identify the candidate genes that possibly cause Tartary buckwheat grain has higher flavonoid content than common buckwheat. Temporal and spatial expression of the candidate genes in these two materials will be analyzed using real-time PCR. 1-2 candidate transcription factors will be cloned. The overexpression and RNAi plasmid of them will be constructed and genetic transformation buckwheat to verify its function. Our work can not only dissect the molecular mechanism that cause the difference of flavonoid content in common buckwheat and Tartary buckwheat grain and identify the candidate genes that possible cause Tartary buckwheat grain has higher flavonoid content, but also provide theoretical foundation and excellent gene resources for molecular breeding in buckwheat.

荞麦富含黄酮类化合物，具有极高的医疗保健价值，已受到人们越来越多的关注和喜爱。提高荞麦籽粒黄酮含量是荞麦育种的重要方向。在两个荞麦栽培种甜荞和苦荞中，苦荞籽粒黄酮含量通常是甜荞的几十倍，但造成这种差异形成的分子机制是不清楚的。本项目拟以甜荞“赤甜1号”和苦荞“晋苦2号”为材料，利用高效液相色谱法（HLPC）分析黄酮在两种荞麦籽粒发育过程中的积累规律；利用高通量转录组测序技术对两种荞麦不同发育时期的籽粒进行比对转录组测序，筛选出可能与苦荞籽粒高黄酮形成相关的候选差异基因；利用实时荧光定量PCR分析候选差异基因在两种荞麦中的时空表达模式；克隆1-2个候选转录因子，构建过表达载体和RNAi干涉载体，遗传转化荞麦进行功能验证。通过本项目的研究，不仅可以剖析两种荞麦籽粒黄酮含量差异形成的分子机制，挖掘苦荞籽粒高黄酮形成的关键基因，还可以为籽粒高黄酮荞麦分子育种提供理论依据和优异基因资源。

荞麦富含黄酮类化合物，具有极高的医药保健作用。提高荞麦籽粒黄酮含量已成为荞麦育种工作的重要方向。在两个荞麦栽培种中，苦荞籽粒黄酮含量是甜荞籽粒含量的几倍至几十倍高，但造成这种差异形成的分子机制是不清楚的。本项目拟通过对二者不同发育时期的籽粒进行比对转录组测序分析，发掘出苦荞籽粒高黄酮形成关键基因并进行功能验证，以期揭示苦荞籽粒高黄酮形成的分子机制。项目主要研究结果如下：1.明确了苦荞和甜荞籽粒发育过程中总黄酮的积累规律，即总黄酮含量随籽粒发育呈先升后降的趋势，并在灌浆高峰期达到最大值。2.完成了二者灌浆前、灌浆高峰期、成熟初期籽粒的转录组测序，鉴定到数十个在籽粒发育过程中呈差异表达的黄酮生物合成结构基因和转录调控基因。3.利用靶向代谢组学对三个发育时期的苦荞籽粒中的黄酮类化合物组分进行了详细分析，共鉴定到234种黄酮类化合物，其中80种黄酮类化合物在苦荞种子发育过程中是差异积累。4.基于苦荞转录组和代谢组数据进行联合分析，鉴定到多个与苦荞籽粒黄酮生物合成密切相关的候选结构基因和转录因子（MYB和bHLH），并利用qRT-PCR和HPLC技术证实了其中鉴定到的一个苦荞籽粒高黄酮形成关键调控基因FtMYBF在不同组织部位的表达量与总黄酮含量和6种黄酮类化合物含量紧密相关。5.克隆了经转录组和代谢组联合分析鉴定到的苦荞籽粒高黄酮形成关键转录因子FtMYBF，并确定其蛋白定位于细胞核，具有酵母激活作用。6.目前正在进行候选调控基因FtMYBF的苦荞毛状根转基因功能验证。7.项目发表论文7篇，其中SCI收录论文4篇，中文卓越期刊1篇，CSCD 论文2篇，申请荞麦新品种保护权5个，培养研究生3人。本项目的实施，为进一步解析苦荞高黄酮形成的分子机制提供了重要的理论基础和关键候选基因，为今后通过分子操作手段培育高黄酮苦荞新品种提供了理论依据和优异基因资源。