柿叶黄酮类单体对阿尔茨海默病的神经保护作用及机制研究

Flavonoids are focus of research at home and abroad in the area of the neuroprotective drugs, flavonoid extract from diospyros kaki leaves （FLDK） improved cognitive function and brain histopathological changes in ICV Aβinduced Alzheimer's disease （AD） rat model, but we did not know the underlie mechanism.In this study, qRT-PCR, TUNEL, transmission electron microscopy, Western blotting and ELISA are used to detect the expression of genes and protein related with neuronal apoptosis, Tau phosphorylation, regulation of related gene and protein and mitochondrial function, synaptic plasticity and other structure and function in APP/PS1 mouse and AD cell model, aimed to discuss the protective effects and molecular mechanisms of FLDK components on neural cell injury model on the overall,cell, molecular and gene levels. Then we can screen the more efficient component of FLDK. The results of the experiment can illustrate neuroprotective mechanisms of FLDK components in AD model and provide evidence for FLDK components as an high efficiency,safety, and economy anti-AD drug.

柿叶黄酮具有保护细胞膜、抗氧化、稳定细胞蛋白质及免疫调节功能，我们前期研究显示，柿叶总黄酮能够改善Aβ侧脑室注射诱导的AD模型大鼠认知功能及脑组织形态学的变化，但其机制不明，我们选用APP/PS1双转基因小鼠、APP/PS1小鼠脑神经元与胶质细胞共培养、人的神经细胞 SH-SY5Y 建立稳定表达 APP695swe 的细胞株，筛选出其高效单体，并采用透射电镜、电生理、TUNEL、qRT-PCR、免疫印迹和ELISA法检测上述模型突触可塑性、炎性反应、Tau磷酸化、Aβ生成相关蛋白、神经元凋亡调控相关基因和蛋白的表达，同时采用基因芯片筛选差异表达基因，从整体、细胞、分子及基因水平探讨高效的柿叶黄酮类单体对神经细胞损伤的保护作用及相关机制，以期多角度揭示AD的发病机制及柿叶黄酮单体保护作用的途径, 在此基础上筛选具有更强防治AD作用的柿叶黄酮类单体，为其应用于AD临床治疗提供理论依据。

阿尔茨海默病主要病理改变包括淀粉样蛋白Aβ沉积、小胶质细胞激活、氧化应激、炎症反应、突触损伤等多方面。黄酮类化合物的神经保护活性涉及多个方面，除了常见的抗氧化作用，还防止神经毒素引起的伤害、抑制炎症反应、降低Aβ生成、提高脑功能、改善认知能力等。我们旨在探讨柿叶中黄酮类化合物（FLDK）对阿尔茨海默病体内外模型的神经保护作用及其机制；鉴定分析黄酮单体成分，发现槲皮素、山柰酚是提取物中主要单体，并进一步探讨了两种单体的神经保护作用。体内实验发现：1）FLDK可以改善APP/PS1转基因痴呆小鼠的空间学习记忆能力；2）FLDK能通过增加p-AMPK、降低p-PERK/p-eIF2α的表达，从而降低Aβ水平及BACE1蛋白表达；3）FLDK能抑制老年斑形成及其周围小胶质细胞活化，显著降低RAGE/细胞核内NF-κB、及其下游炎症因子TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS表达，而增加胞浆NF-κB表达；4）FLDK可以降低8-OHDG水平，提高SOD、GSH-Px抗氧化酶活性，减少脂质过氧化产物MDA生成；5）FLDK改善突触结构，降低RhoA-GTP活性，增加p-ERK1/2、p-CREB、SYP及Drebrin等突触相关蛋白的表达；6）FLDK对APP、PS1、tau过度磷酸化及相关蛋白表达的作用不显著。体外实验发现，提取物可以提高HEK293-APPswe细胞活性，降低细胞氧化应激水平，减少Aβ1-42分泌，增加Nrf2、HO-1氧化应激调控蛋白表达水平。对比黄酮单体槲皮素、山柰酚对HEK293-APPswe细胞的保护作用，结果发现槲皮素、山柰酚均能够提高细胞活力，降低细胞外Aβ1-40、Aβ1-42分泌，降低ROS及MDA含量，增加SOD活性及GSH含量，槲皮素效果优于山柰酚。因此，FLDK通过减少BACE1蛋白表达减轻Aβ沉积，同时具有抗氧化、降低炎症反应、改善突触结构及增加突触相关蛋白表达从而改善学习记忆能力。其主要单体槲皮素、山柰酚同样对细胞模型具有保护作用，可以提高细胞活力、降低Aβ分泌、减轻氧化应激及炎症状态，槲皮素对细胞的保护效果优于山柰酚。