采用反向疫苗学技术研制欧洲鳗鲡病原菌外膜蛋白基因工程二联疫苗

鳗鲡是我国单品种出口创汇最多的水产品之一，而鳗鲡养殖业长期受多种细菌性病原的侵扰。本研究拟在前期分离获得全国不同养殖区欧洲鳗鲡多种病原菌的基础上，采用反向疫苗学研究技术，利用生物信息学软件对网上已递交的水产动物病原菌重要保护性抗原基因- - 外膜蛋白基因进行比对分析，并以高度保守序列设计引物，采用近10年从发病鳗鲡分离的病原菌基因组为模板，扩增其外膜蛋白基因片段并进行序列分析，以融合PCR技术将扩增到的片段进行体外两两拼接，构建表达载体并在原核表达系统中高效表达，表达产物经鉴定和纯化后免疫欧洲鳗鲡，评测免疫后不同时间点鳗鲡体液特异性抗体的价效、淋巴细胞增殖水平和同时抵抗多种病原菌感染的能力，从而获得欧洲鳗鲡基因工程二联疫苗。本研究结果将推动反向疫苗学技术在水产动物疫苗研制中的应用，为水产动物疫苗的开发提供参考，为从源头上解决鳗鲡产品的药残超标问题提供新思路。

为研制鳗鲡病原菌外膜蛋白基因工程二联疫苗，本研究克隆鳗鲡3个主要病原菌属外膜蛋白的基因全长，选择位于膜外部分可接触免疫系统的基因片段，设计接头两两连接后构建了气单胞菌与迟顿爱德华氏菌（pGEX-2T-porinⅡ-ompS2-His）、气单胞菌与创伤弧菌（pGEX-2T-porinⅡ-ompU-His）和创伤弧菌与迟顿爱德华氏菌（pGEX-2T-ompU-ompA -His）等3个重组表达载体。采用不同的IPTG浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度探讨了载体的表达条件。结果发现一定范围内的IPTG浓度、温度、时间和诱导时菌液浓度对载体表达无明显影响。本研究在菌体浓度 OD600nm为0.6-0.8时，采用0.25mM的 IPTG经16℃诱导过夜后，表达产物经纯化后获得分子量分别为87.1 kD（porinⅡ-ompS2）、82.2 kD（porinⅡ-ompU）和77.6kD（ompA-ompU）的二联蛋白。蛋白经透析复性后，皮下注射免疫PBS(含不同时间进行的3次试验)，嗜水气单胞菌与迟顿爱德华氏菌（FKC-AE）、嗜水气单胞菌与创伤弧菌（FKC-AV）和爱德华氏菌与创伤弧菌（FKC-EV）二联灭活苗，气单胞菌与迟顿爱德华氏菌（ompⅡ-S2）、气单胞菌与创伤弧菌（ompⅡ-U）和迟顿爱德华氏菌与创伤弧菌（omp A-U）二联表达产物等9组鳗鲡。免疫后于不同时间点采血并分离血细胞、血清和粘液。测定鳗鲡血细胞的免疫水平、血清特异性抗体以及血浆、粘液和肝肾组织匀浆中溶菌酶含量。免疫后28 d，嗜水气单胞菌、迟顿爱德华氏菌和创伤弧菌分别攻毒感染鳗鲡。结果表明，ompⅡ-S2免疫后21d淋巴细胞转化水平显著（P<0.05）高于PBS组；ompⅡ-U和ompA-U免疫后28d全血细胞转化水平显著（P<0.05）高于PBS组；免疫组14、21和28 d的抗体水平显著（P<0.01或P<0.05）高于PBS组。不同试验组不同时间段血清、粘液和肝肾组织悬液的溶菌酶含量也存在显著（P<0.05或P<0.01）差异。与PBS组相比，二联外膜蛋白免疫后28 d对嗜水气单胞菌和创伤弧菌的攻毒相对保护率均提高了50%以上；对迟顿爱德华氏菌提高了37.5%以上，且与对应的二联灭活疫苗保护效果相当。本研究表明二联基因工程表达产物均可能作为鳗鲡病原菌外膜蛋白基因工程二联疫苗。