氧调控奥奈达希瓦氏菌降解偶氮染料的机理研究

Oxygen is one of critical parameters for bacterial degradation of azo dyes. In previous study, azo bond of methyl red can be broken by S. oneidensis MR-1 under anaerobic and microaerophilic conditions. Furthermore, the 2-aminobenzoic acid and N,N′dimethyl-p-phenyle-nediamine generated by azo bond cleavage can be degraded by S. oneidensis MR-1 under aerobic and microaerophilic conditions. The azoreductase of S. oneidensis MR-1 was cloned and had high catalytic activities toward methyl red. Based on the previous study, this project would focus on the regulation mechanism of enzymes (azoreductase and degrading enzymes of N,N′dimethyl-p-phenyle-nediamine and 2-aminobenzoic acid) by S. oneidensis MR-1 under different oxygen conditions. The degrading enzymes of 2-aminobenzoic acid and N,N′dimethyl-p-phenyle-nediamine would be obtained by the analysis of transcriptome and proteome, and be verified by construction of gene deletion mutant strains. The characteristics of degrading enzymes would be investigated via heterogenous expression. Northern blot and electrophoretic mobility shift assay would be used to identify the transcription unit and transcription initiation factor of azoreductase and degrading enzymes of N,N′dimethyl-p-phenyle-nediamine and 2-aminobenzoic acid. Realtime fluorescence quantitative PCR would be applied to detect the expressive abundance. Combined with the parameters like oxidation reduction potential, detail profile of the regulation mechanism of azo dye degradation by S. oneidensis MR-1 under different oxygen conditions would be revealed.

氧是影响细菌降解偶氮染料的重要因素。前期发现Shewanella oneidensis MR-1厌氧和微氧条件下断裂甲基红偶氮双键进行脱色；微氧和好氧条件下能将偶氮双键断裂形成的4-氨基-N,N-二甲基苯胺和邻氨基苯甲酸完全矿化。异源表达该菌偶氮还原酶，其对甲基红催化效率高。本项目在前期基础上，研究氧对于降解过程关键酶（偶氮还原酶，4-氨基-N,N-二甲基苯胺和邻氨基苯甲酸降解酶）的转录表达调控机理。通过转录组、双向蛋白电泳和基因缺失突变获得4-氨基-N,N-二甲基苯胺和邻氨基苯甲酸降解酶。通过Northern 印迹和凝胶迁移率分析确定不同氧条件下S. oneidensis MR-1染料降解关键酶的转录形式、转录因子，采用荧光定量PCR等研究不同氧条件下关键酶的表达丰度、活性。结合细胞内氧化还原电势、辅酶浓度与比例等指标，揭示氧影响S. oneidensis MR-1降解偶氮染料的机理。

纺织业和印染业是我国染料使用的主要行业。随着染料用量的逐年增加，染料废水排放导致的环境污染问题也日益凸显。目前，印染业使用的染料包含大量人工合成的偶氮染料。偶氮染料的结构比较稳定，自然条件下能够抗碱、抗酸和抗光降解。排放到环境中且含偶氮染料的废水对生物体具有潜在的三致效应（致癌、致畸、致突变）。希瓦氏菌属的模式生物Shewanella oneidensis MR-1在微氧条件下能够降解偶氮染料，但降解过程在好氧条件下被抑制。目前，关于S. oneidensis MR-1偶氮还原过程的机理以及氧抑制该偶氮还原过程的机理研究甚少。此外，作为降解偶氮染料的关键酶，蛋白质数据库中暂无S. oneidensis MR-1偶氮还原酶（soAzoR）的晶体结构。因此，有关soAzoR的活性位点以及其与底物等的相互作用方式研究也较少。为阐明上述机制，本研究采用基于NMR的代谢组技术和基于RNA-Seq的转录组技术分析了S.oneidensis MR-1在不同氧条件下以甲基橙为底物时代谢水平和转录水平的变化；采用同源建模、分子对接以及单氨基酸突点等方法分析了soAzoR与FMN、NADH和底物（甲基红）的作用方式及作用位点。结合代谢组和转录组数据提出氧调控偶氮染料降解过程的机制：soAzoR与呼吸链电子传递复合体I想毗邻，偶氮还原过程可以看作呼吸电子传递的一个分支；氧分子作为呼吸电子传递链的终端电子受体，与偶氮染料竞争性的接受电子。soAzoR的三维结构一共包含6个α-螺旋和7个β-折叠，采用典型的罗斯曼折叠构象，酶的活性口袋只能通过同源二聚体形成。本项目的完成顺利的揭示了氧含量调控S.oneidensis MR-1降解偶氮染料的机理。