3D打印组织工程气管的构建及其再上皮化、再血管化的实验研究

Tracheal transplantation is an effective treatment for long segment tracheal defect. The re-epithelialization of tracheal epithelium, revascularization of transplanted graft，and lack of trachea donors are the main reasons for restricting the development of lung segment tracheal transplantation. Nevertheless, tissue-engineered trachea becomes a new direction in this area. Our former research showed that pre-lactic acid-caprolactone copolymer (PLLACL) had reliable biological properties and physical characteristics for 3D printing. Also, electrostatic spinning tissue-engineered trachea helped to the re-epithelialization and revascularization of trachea graft. However, the complicated process and long cycle of its production limit the application of this technique in clinical fields. Since 3D printing can produce tracheal tissue engineering materials quickly and accurately, our research plans to build 3D printing biological tissue-engineered trachea fragments with double-layer structure, dense inner structure for epithelium planting and soft outer structure for chondrocytes planting, and then apply it in animal orthotopic transplantation. This research focuses on the characteristics of 3D printing trachea including porosity, cell seeding density, tissue compatibility, mechanical and physical properties, tracheal epithelium re-epithelialization and revascularization. Also, our research assesses the survival rate of transplanted animals. Overall, we aim to accumulate experimental data and technical parameters for the clinical application of new alternative trachea graft.

气管移植是治疗长段气管缺损疾病的有效方法。气管上皮的再上皮化、移植物的再血管化以及供体缺乏等是阻碍长段气管移植发展最主要因素。为解决这些困难，组织工程气管已成为这一领域的新方向。本课题组前期研究显示乳酸己内酯共聚物具有可靠的生物学性能及适合3D打印的物理学特点，同时静电纺织组织工程气管有助于移植气管再上皮化、再血管化。但其制作工艺复杂，生产周期长的缺点，制约了该技术的临床应用前景。3D打印凭借其精确快速稳定的技术特点成为组织工程发展的理想工具。本课题将构建具有内层结构致密适合种植上皮细胞，外层结构疏松适合种植软骨细胞的双层3D打印生物组织工程气管片段，并在动物体内行原位移植。研究3D打印气管的孔隙率与细胞种植密度，组织相容性，机械物理性能，气管上皮再上皮化以及再血管化的特点，并评估3D打印气管对移植动物的存活率影响。本研究旨在积累相关实验数据和技术参数以优化新型移植气管替代物在临床的应用。

肿瘤、外伤和先天性狭窄等可导致气管严重狭窄，造成呼吸困难甚至危及生命。气管环形切除和重建术是目前最有效的治疗方案，但是当气管切除范围过大时，切缘由于张力原因无法进行“端端吻合”。此时，为了恢复气管的通畅性和呼吸通气功能，需要植入具有良好生物相容性的气管替代物。.脱细胞的生物支架是组织工程气管研究的热点。然而，脱细胞支架存在制作工艺复杂、制作周期长、气管支架来源稀缺等问题，限制了其在临床上的应用。为了解决这些问题，我们创新地利用3D生物打印技术设计了一种具有三层复合结构的组织工程气管。最外是附加凹槽设计的聚乳酸-羟基乙酸／聚乙二醇（PLGA/PEG）共聚物骨架，中间为载软骨细胞的水凝胶，最内是含有气管上皮细胞的水凝胶。我们从气管活性细胞的提取、气管支架的打印参数确定、细胞-凝胶-支架光交联、动物体内实验等方面展开了研究。.本项目证实，采用支气管镜下活检法提取上皮组织可以培养出具有良好生物学活性的原代气管上皮细胞，剪取比格犬耳廓组织可以提取到足量的软骨细胞，用于组织工程气管的生物学功能重建。PLGA/PEG骨架的机械性能随着PEG比例的增加而降低，溶胀率和降解率则随着PEG的增加而增加。GelMA水凝胶的强度和粘度均随着浓度的提高而增加。综合考虑，采用含有5%PEG的复合材料配方制作硬材料支架层，含有10%GelMA的生物墨水构建含细胞软材料层，可以达到最佳打印效果。PLGA/PEG复合材料具有良好的生物相容性，不会干扰上皮和软骨细胞的生长。包裹在GelMA生物墨水中的两种细胞经过生物打印和光交联的过程，能够保持良好的存活率和增殖能力。在动物体内移植早期(一周)，最外骨架层提供了良好的机械性能，为种子细胞的生长和血管的长入提供了空间。移植四周后，支架分泌出基质并形成条状软骨。上皮细胞呈团状生长，形态结构尚欠缺。八周后，大部分骨架层材料被降解，受体自体细胞和血管长入，形成了高度仿生的气管结构。本研究证实了3D生物打印构建组织工程气管的可行性，值得进一步的探索和优化。