细胞自噬在弓形虫增殖中的作用及信号转导的干预

弓形虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，人群中感染普遍并呈上升趋势。至今仍没有理想的治疗弓形虫病方法，因此对弓形虫的致病机制以及针对性治疗的研究越来越迫切。申请者根据已有的研究结果和文献报道推测细胞自噬及其ClassⅢPI3K自噬信号通路在弓形虫感染增殖过程中很可能起重要作用。为了证实这一假说，本项目通过①检测弓形虫感染诱导宿主细胞自噬的程度；②使用抑制剂、促进剂、超表达关键基因及siRNA实验，分别抑制和促进细胞自噬及其ClassⅢPI3K信号通路情况下，检测自噬及其ClassⅢPI3K信号通路对弓形虫感染增殖的影响；③筛选弓形虫与ClassⅢPI3K信号通路相互作用的蛋白质；④在体实验进一步验证并对治疗前景初探。预计本研究将掌握自噬及其ClassⅢPI3K信号通路在弓形虫感染致病中的作用，建立弓形虫感染致病机制新的理论基础，并为有效的干预和治疗提供新的途径。

弓形虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，人群中感染普遍并呈上升趋势。至今仍没有理想的治疗弓形虫病方法，因此对弓形虫的致病机制以及针对性治疗的研究越来越迫切。本方案系统研究了细胞自噬及其ClassⅢPI3K自噬信号通路在弓形虫感染增殖过程中作用：..1. 检测弓形虫感染诱导宿主细胞自噬的程度：将弓形虫（RH株）速殖子悬液分别以虫/细胞2:1、4:1、8:1、16:1感染HEF(人包皮成纤维细胞)，作用1d、2d、4d，采用吖啶橙荧光染色、MDC（Monodansylcadaverin）荧光染色、转染GFP-LC3检测和透射电镜检测检测HEL细胞自噬情况，结果表明与对照组相比，接种不同量弓形虫后HEF细胞质内可见大量红色自噬泡，且随着时间延长变化趋势越来越明显，同时自噬程度与弓形虫感染量呈正相关。.2. 使用抑制剂、促进剂、转染基因及siRNA实验，将弓形虫（RH株）速殖子悬液分别以虫/细胞2:1、4:1、8:1、16:1感染HEF细胞, 作用1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h。采用吖啶橙荧光染色和MDC荧光染色检测HEL细胞自噬情况，结果表明促进宿主细胞自噬有利于弓形虫增殖复制，抑制宿主细胞自噬可抑制弓形虫增殖。.3. 采用酵母双杂交筛选弓形虫 cDNA文库，发现弓形虫p21、p30蛋白可与以ClassⅢPI3K相互作用，再通过回交试验试验验证证实弓形虫p21蛋白可与以ClassⅢPI3K相互作用。.4. 建立弓形虫感染小鼠模型，通过透射电子显微镜检测模型小鼠肝组织可见细胞自噬现象，Western Blot检测各组小鼠肝组织ClassⅢPI3K表达上调。注射自噬抑制剂和ClassⅢPI3K抑制剂，模型小鼠肝组织虫荷降低。.该项目研究结果使我们了解掌握细胞自噬及其ClassⅢPI3K信号通路在弓形虫感染增殖中的作用，建立了弓形虫感染致病机制新的理论基础，并为有效的预防和治疗弓形虫感染提供了新途径。