柠檬酸转运相关基因的挖掘及对草莓果实酸度的调控机制研究

Citrate transport plays an important role in fruit acidity control. However, mechanism of citrate transport remains to be clarified. Some members of MATE gene family, which implicates in citrate efflux, can help Al detoxification and Fe translocation. However, whether MATE protein can transport citrate in fruit is still unknown. The project is to identify citrate transport associated genes and their regulatory mechanism in fruit acidity. Firstly, organic acid and MATE gene family expression during fruit ripening and postharvest storage will be investigated in different acidity strawberry varieties. Secondly, RNA will be extracted from fruit with obvious organic acid change for RNA-Seq. Combined with bioinformatics analysis, the possible citrate transport genes will be chosen. Thirdly, the function of 2-3 possible citrate transport genes will be verified by subcellular localization, tissue specific expression and differential expression in fruit in different acidity strawberry varieties, heterologous expression in transgenic tomato. These results will contribute to reveal the molecular mechanism of citrate transport and acidity control in fruit, explore the mechanism of fruit quality formation and regulation, and provide theoretical suggestion for improving fruit quality.

柠檬酸的转运调控是影响果实酸度的关键因素之一，但柠檬酸的转运机制还不甚清楚；MATE基因家族部分成员可以通过介导柠檬酸的转运在铝的解毒及铁的转运中发挥作用，但MATE基因是否在果实中具有转运柠檬酸的功能仍是有待解决的科学问题。本项目拟开展柠檬酸转运相关基因挖掘及对果实酸度的调控机制研究，主要内容包括：通过对不同酸度品种草莓果实成熟及采后贮藏过程中有机酸的动态变化规律研究、MATE基因家族的基因表达及生物信息学分析、有机酸变化关键点果实样本的RNA-Seq分析，筛选柠檬酸转运的关键基因；挑选2-3个关键基因，通过亚细胞定位、不同酸度果实品种中的组织特异性表达及果实中的差异表达分析、转基因番茄中的异源表达研究，验证关键基因在果实酸度调控中的功能。以上研究结果对于揭示果实柠檬酸转运及对酸度调控的分子机理具有重要意义，有助于理解果实品质形成与调控的分子基础，并为提高和改善果实品质提供理论指导。

影响果实品质的三个因素分别是糖、有机酸和芳香物质，半个多世纪以来国内外相关研究主要集中在糖代谢研究，有机酸研究和芳香物质的代谢机理研究相对滞后。对有机酸物质代谢及调控机理的研究是近年来果实品质生物学中倍受关注的科学问题，尤其是可能影响果实酸度的有机酸跨膜运输机理，其中介导柠檬酸转运的主要载体依然不清楚。植物MATE蛋白家族的部分成员可以通过介导柠檬酸的转运在铝的解毒及铁的转运中发挥作用，但MATE基因是否在果实中具有转运柠檬酸的功能仍是有待解决的科学问题。本项目通过测定不同酸度草莓品种（章姬、红颜、四季）的果实在生长发育及采后贮藏过程中有机酸的含量，揭示了草莓果实柠檬酸的动态变化规律；利用RNA-Seq对不同生长发育阶段的章姬和红颜果实进行了转录组测序，筛选出了果实成熟过程中的差异表达基因；结合已测序栽培草莓果实中MATE基因家族与已知功能MATE蛋白的系统发生树构建，挖掘出了栽培草莓果实中可能介导柠檬酸转运的MATE基因；以章姬草莓为材料，克隆了3个可能的柠檬酸转运子MATE基因，发现其与测序的栽培草莓卡姆罗莎中的MATE基因在序列上有较大的差异，克隆到的3个MATE基因全长翻译出的蛋白质序列都具有与已知柠檬酸转运子相同的12次跨膜的结构域，其中的2个具有高度保守的位于TM2和TM3之间的胞内环，推测这2个基因可能介导了草莓中的柠檬酸转运；采用荧光定量PCR的方法发现3个MATE基因在章姬草莓果实发育过程中具有不同的表达模式，亚细胞定位预测显示三者具有不同的定位，推测具有上调表达模式的定位于液泡中的2个MATE（具有胞内环结构域）可能具有柠檬酸转运的功能；2个关键MATE基因在果实酸度调控中的功能研究还在进行中。以上研究结果对于揭示果实柠檬酸转运及酸度调控的机理具有重要意义，为理解果实的品质形成与调控的分子基础，提高和改善果实品质提供了理论指导。