草莓果实糖转运蛋白亚细胞定位调控对风味品质的影响

The flavor and quality of fruit are directly affected by the kinds and content of soluble sugar, of which the fructose sweetness is the highest. The sugars in the fruit are transported to a variety of organelles by sugar transporters, in which tonoplast sugar transporters play an important role in the tonoplast sugar accumulation during the late fruit development. Previously, we have performed the homologous analysis and searches on the genome of the forest strawberries and found 16 important sugar transporter genes,by which the gene29572 and FaSUT4 were considered to be suspected fructose transporter genes through analysis of the evolutionary tree and transmembrane structure. Based on this, the temporal and spatial changes of sugar transporter genes expression will be confirmed and quantitatively analyzed. The functions and subcellular localization of important sugar transporters being aim to enhance the sugar content will be characterized through the allograft yeast expression system. The technical pathway to enhance the sugar content in the fruit cytoplasms and vacuoles and their impacts on the development and quality of the strawberry fruit will be studied through RNA interference, gene overexpression, fruit-specific promoters. This study will reveal the impact of subcellular localization regulation of sugar transporters on the development flavor and quality of the strawberry fruit. The results will help to construct the new pathway for fructose transmembrane transporting and improve the flavor and quality of the fruit, thus providing important theoretical values.

果实风味品质受糖分的种类和含量的影响。果糖在可溶性糖中甜度最高，且对人体有保健作用。果实中的糖分通过糖转运蛋白运输到不同的细胞器中，而在果实发育后期，液泡膜糖转运蛋白，对糖分进入液泡起关键作用。此前，我们对森林草莓全基因组进行了同源序列分析和查找，已发现16条糖重要转运蛋白基因，经进化树和跨膜结构分析认为，gene29572和FaSUT4极有可能为果糖转运蛋白基因。本试验将在此基础上，定量观察草莓糖（果糖）转运蛋白基因表达的时空变化，应用酵母异体表达系统，研究糖转运蛋白的功能及亚细胞定位的技术途径；并通过RNAi、基因过表达、果实专一性启动子等手段，探索提高草莓果实中糖（果糖）含量的方法。本研究拟在明确草莓糖转运蛋白功能的基础上，探明转运蛋白亚细胞定位调控，对果实亚细胞中糖分种类和果糖含量的变化。试验结果对揭示转运蛋白在草莓果实细胞中的表达特性，构建糖跨膜运输的新通道，具有重要的理论价值.

果实品质（除外观品质外）主要由可溶性糖、有机酸及香气物质、维生素等组成，其中可溶性糖直接影响果实的营养价值、风味口感等品质性状。果实中的果糖在所有糖中甜度最高，果糖含量高更有利于提高果实的风味品质。. 实验以丰香和红颜草莓为试材，依据拟南芥多元醇/单糖转运体1（AtPMT1）被报道主要负责木糖醇和果糖的跨膜转运，以及单糖转运体具有高度同源性，本研究以AtPMT1为模板，与草莓基因组（http://www.strawberrygenome.org/）比对分析后，获得13条疑似果糖转运体基因。在草莓不同发育阶段的叶片、花和果实中对获得的13条基因定量分析发现：g-31477与果实中果糖的代谢呈现明显正相关，而g-20355在果实中表达明显高于叶片和花中，故以g-31477为主要研究对象。以红颜草莓cDNA为模板，克隆得到基因g-31477的全长（其中CDS的长度为2562bp、该基因编码854个氨基酸）。通过Kpn I和Xba I位点将该基因成功连入载体pCAMBia2300，并转化至根癌农杆菌GV3101。. 采用瞬时表达方式验证g-31477基因功能。结果表明，果实中糖的含量与对照相比，且差异达极显著水平；处理其中果糖提高了45.5%、葡萄糖提高了49%、蔗糖提高了129%，表明g-31477具有转运单糖的特性。采用酵母表达方式验证g-31477基因功能。通过构建酵母表达载体EBY•VW-4000，以及缺陷型酵母互补实验。结果表明，含有糖转运蛋白基因的质粒可将培养基中的单糖（果糖、葡萄糖和甘露糖、半乳糖）转运给酵母菌使其成活，也表明g-31477具有转运单糖的特性。采用遗传转化方式验证g-31477基因功能。已构建的质粒转化草莓叶片，经优化筛选出6BA（3mg L-1）+IBA（0.2 mg L-1）激素处理，为草莓遗传转化诱导愈伤组织比较理想的组合。采用异源表达方式验证g-31477基因功能。通过构建草莓过表达载体31477-pBI121-TPRP-F1(特异性果实启动子)导入农杆菌GV3101，将筛选出了阳性菌用以转化野生型番茄，目前子叶已经长出愈伤。. 以上研究结果，对揭示转运蛋白在草莓果实细胞中的表达特性，构建糖跨膜运输的新通道，探明果实中糖的积累和转运机制，提升果实风味物质，具有重要的理论价值。