水稻细菌性条斑病菌对噻唑锌抗药性相关基因的克隆及其功能研究

Zinc thiazole is a newly independently developed bactericide in China, which exhibited strong inhibitory activity against Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. But the mechanism of resistance to zinc thiazole is still unclearly understood. In order to clone the resistance-related gene(s), the objctives of this program are to: (1) established the Tn5 insertional mutants library from the zinc thiazole-resistant X. oryzae pv. oryzicola strain and the identify the transformants which lost the resistance to zinc thiazole; (2) amplify the flanking sequences of the Tn5-inserted gene through tail-PCR and get the whole sequence of the gene (resistance-related gene) based on the information through NCBI;(3) amplify the whole gene from the zinc thiazole-sensitive and -resistant X.oryzae pv. oryzicola strains with sequencing and blasting, so as to investigate the relationship between the gene and the resistance; (4) creat the in-frame deleted mutants and the complementary mutants, identify the gene function through PCR and blots, explore the characters of the mutants and the biological properties of the resistance-related gene and its relationship with pathogenicity. This would make basis for the molecular mechanism of resistance to zinc thiazole in X. oryzae pv. oryzicola. The results of this program would not only provide important information on the resistance risk of zinc thiazole, but also lay the theriotical foundation for the scientific use, resistance monitoring and delay of this bactericide resistance.

噻唑锌是我国自主开发的一种新型杀细菌剂，对水稻细菌性条斑病菌具有较高的抑制活性，但抗药性机制并不是很清楚。为克隆抗药性相关基因，本项目研究内容为：（1）通过构建抗噻唑锌的水稻细菌性条斑病菌的转座子插入突变基因文库，以丧失抗药性遗传表型为指标筛选转化子；（2）通过Tail-PCR扩增被Tn5转座子插入而破坏的基因（简称为抗药性相关基因）的侧翼序列，根据NCBI的信息获得该基因的全序列；（3）扩增抗、感菌株中的抗药性相关基因，经比对、分析，明确该基因与病原菌抗药性之间的关系；（4）构建敲除突变体及回复突变体，通过PCR及杂交验证抗药性基因，明确突变体的生物学性质，揭示该基因的生物学功能及其与致病性的关系，从而为探明水稻细菌性条斑病菌对噻唑锌的抗药性分子机制奠定基础。其结果不仅能够为噻唑锌的抗药性风险评估提供重要的参考依据，而且为该药剂的科学使用、抗药性监测以及延缓抗药性的产生提供理论基础。

噻唑锌是我国自主开发的一种新型杀细菌剂，对不同细菌的生物学活性不同，主要对黄单胞杆菌（Xanthomonas spp.）病害有防治活性。由于该药剂引入了锌元素，且该药剂噻唑基团的连接方式也与其它噻唑类药剂不同，因此推测该药剂的作用机理可能与其它噻唑类药剂有差异。对于该药剂的作用机制和抗药性机理尚未报导，探索新药噻唑锌抗药性相关基因及可能的抗药性机制，对于未来在蛋白水平上研究新型杀菌剂与病原菌靶标的亲和作用及其干扰因素等，具有重要的理论价值；同时将有助于提高人们防治水稻细菌性条斑病的水平。基于此，本青年基金的研究目标是以水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）菌株AH12为出发菌株，诱导并获得了水稻细菌性条斑病菌对噻唑锌的抗药性菌株，并通过转座子构建抗药性菌株随机插入突变核基因组文库和药剂处理的转录组分析，寻找噻唑锌处理相关的靶标基因和抗性相关基因，并进行相关研究。通过3年的资助，本项目取得了如下进展：.第一, 本项目通过紫外诱变和药剂诱变的方法获得了稳定遗传的抗性菌株，其中紫外诱变的抗性菌株的EC50在50.32~109.3µg/ml之间，平均EC50为81.06µg/ml，平均抗药性倍数为25.8。.第二，为克隆抗药性相关基因，在此基础上我们以两亲交配的方法构建抗噻唑锌的水稻细菌性条斑病菌的转座子插入突变基因文库；以丧失抗药性遗传表型为指标筛选转化子，但所有筛选的2414个转化子都没有丧失抗药性。.第三，通过测定药剂处理后病原菌的DNA、胞外多糖、蛋白质等生物大分子含量，表明不同浓度的噻唑锌对细菌性条斑病菌的生物大分子合成并没有显著影响。在此基础上我们进行了药剂处理的转录组分析，得到了水稻细菌性条斑病菌被药剂处理后差异表达的基因的数量、种类与功能，并初步揭示了菌株与抗性相关的基因及其功能。.项目执行内，发表研究论文 7篇，其中 SCI 研究论文7 篇，包括 1 篇植物病学研究领域的重点刊物 Plant disease，申请专利并授权3项。本研究完成了项目规定的考核指标。